过继细胞疗法（ACTs）出现至今已有几十年时间，CAR-T细胞的成功更是革新了ACTs治疗领域，但同时也清楚的显现出其局限性。未来的肿瘤治疗如要更好的发挥ACTs作用，就要对其存在的问题有着深刻的认识和分析，并积极探索解决方法。近期，中国科学院深圳先进技术研究院学者发表于《血液学与肿瘤学杂志》（Journal of Hematology & Oncology）的一项综述，详细描述了ACT领域药物的发展、优势和可能面临的挑战以及解决方法，并概述了基因转染策略在免疫细胞工程中的重要性以及存在的问题和解决方法。【肿瘤资讯】整理如下，以下读者。
往期回顾：（一）TIL与TCR ‐ T篇：过继细胞疗法——新技术与新挑战
CAR-T：成功后的挑战
CAR的结构
CAR结构由4部分组成，包括（1）胞外靶结合区：体现了CAR-T细胞的靶向特异性，过高或过低的亲和力均可影响其作用，电荷密度、表位位置和靶抗原密度也可影响CAR的作用；（2）绞链区：连接靶结合区和穿膜区，其长度也可影响CAR的作用；（3）穿膜区：锚定CAR于胞膜上，可影响CAR的表达和稳定性、免疫突触形成以及内源性信号分子的二聚化；（4）胞内信号区：包括信号转导区和共刺激区，前者可模拟TCR的信号转导功能，后者则协同共刺激分子增强胞内活化信号。
CAR的发展
1.一代CAR：1997年Eshhar建立了第一个CAR（图3B），但因缺少共刺激信号，T细胞易发生耗竭。
图3 CAR的基本结构和发展
2.二代CAR：引入共刺激分子4-1BB，目前市场化的8个CAR-T细胞产品均为二代CAR。研究证实共刺激分子的存在能显著延长CAR-T细胞的持久性，这对于长期监视和去除肿瘤细胞具有重要作用。
3.三代CAR：引入二个共刺激分子，虽然持久性和扩增更优，但对血液肿瘤的治疗作用并不显著优于二代CAR-T细胞，对实体瘤可能更具因势，因实体瘤的TME更复杂，可显著限制T细胞活化和持久性。
4.新一代CAR：对实体瘤仍不具明确的治疗作用，需克服的问题包括如何更好的定位并进入肿瘤组织、更精准的杀伤肿瘤细胞、长期增殖并保持抗肿瘤活性、拮抗TME的抑制作用、减少CRS和神经毒性（NT）以及通用性更优（图4）。
图4 新一代CAR的目标以及针对实体瘤治疗的CAR设计
a.逻辑门控CAR
逻辑门控CAR-T细胞依赖多种刺激/抑制抗原介导的信号，提高其识别能力、克服肿瘤异质性。
1.“OR”逻辑门控CAR：实现此种治疗的最简单方法是输入多个靶向不同抗原的CAR-T细胞，但工作量大，潜在毒性也有待明确；另一种方法是串联CAR，胞外区有超过二个的抗原识别基序，不同的TAAs均可活化，此种治疗的毒性需要重视。SUPRA CAR系统的CAR由zipCAR和游离zipFv组成，不同的zipCAR/zipFv配对可转换为不同的逻辑门控模式，同时加入二种或多种zipFv就可形成“OR”逻辑门控CAR，靶向多个抗原。zipFv较短的半衰期限制了其应用。
（2）“AND”逻辑门控CAR：”AND”逻辑门控的作用是通过同时识别二个TAAs才能发挥CAR-T细胞作用，减少对正常细胞的损伤。Split CAR-T细胞采用了“AND”逻辑门控，其缺点与一代CAR-T细胞相同，易耗竭。SynNotch CAR-T细胞通过依次识别二个抗原而更准确的识别肿瘤细胞，但CAR活化时长达24小时，治疗作用具有空间限制性，安全性亦需要明确。SUPRA CAR系统也可实现”AND”逻辑门控。上述细胞仍不可避免对正常细胞造成损伤，Majzner的LINK CAR-T细胞采用ZAP-70代替4-1BB/CD3ζ，ZAP-70需要识别T细胞激活链（LAT）和SLP-76才能激活下游信号，从而减少了靶向非肿瘤效应。
（3）“AND-NOT”逻辑门控CAR：在细胞表面同时表达活化CAR和抑制CAR（iCAR），iCAR能识别非肿瘤细胞表面抗原，抑制CAR-T细胞活化，减少对非肿瘤细胞的损伤。SUPRA CAR系统可实现这一功能。
b.适配-依赖CAR
此类CAR通过增加外源性配体，控制对不同TAAs的识别（图3Ed），如BBIR（生物素结合免疫受体）CAR和抗FITC（异硫氰酸荧光素）CAR。SUPRA CAR系统通过加入不同的zipFvs也可实现类似功能。
4.3 药物开关CAR（图3Ee）
（1）On-switch CAR：只有使用某种药物时，CAR功能才能实现。Tet-ON系统使用多西环素激活逆转录四环素转录激活因子（rtTA），诱导CAR表达，此过程需24小时，撤药后恢复至基线需48小时，对于易发生CAR相关急性致死性毒性病例不适合，此外还可能导致抗菌素耐药。另一种On-switch CAR采用小分子药物rimiducid诱导MyD88/CD40（iMC）二聚化激活NF-κB传递共刺激信号，iMC CAR-T的抗肿瘤作用优于传统二代和三代CAR-T细胞。
（2）Off-switch CAR
Off-switch CAR-T细胞治疗期间发生风险时，可通过药物关闭其功能，减少损伤。SWIFF CAR和iCasp9 CAR通过使用蛋白酶抑制剂asunaprevir和小分子药物rimiducid终止其作用，动物研究显示达沙替尼可通过抑制CD3ζ阻止CAR-T细胞功能，此外还可令CAR-T细胞表达某些特定抗原，利用ADCC和CDC作用去除CAR-T细胞。
4.4 分泌性CAR
CAR-T细胞通过分泌功能性分子，可增强其在实体瘤中的浸润能力、特异性和持久性（图3Ef）。
分泌CD3/CD19 BiTE的抗CD19 CAR-T细胞，分泌CD3/EGFR BiTE的靶向EGFRvIII CAR-T细胞、分泌CD3/Fn14 BiTE的CAR-T细胞、分泌CD3/B7-H3 BiTE 的CAR-T细胞、分泌CD3/EGFR BiTE的CAR-T细胞和分泌CD3/IL13Rα2 BiTE的CAR-T细胞，均因增加了旁观者T细胞作用而增强了抗肿瘤作用，但其安全性有待进一步明确。CAR-T细胞还可通过分泌某些细胞因子而增强内源性抗肿瘤反应，分泌IL-12、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-18和IL-33的CAR-T细胞均具有上述作用。肿瘤组织的胞外基质（ECM）可显著影响CAR-T细胞浸润，可分泌降解ECM酶的CAR-T细胞的肿瘤内浸润改善。CAR-T细胞还可通过分泌抗PD-L1抗体，利用ADCC作用清除肿瘤细胞。外泌体作为信号传导介质，可实现多种生物功能，因此能够分泌外泌体的CAR-T细胞可通过多种机制达到治疗目的，不但疗效前景看好，安全性也较好。
4.5 TME反应性CAR
TME的特征包括免疫抑制性细胞和细胞因子、酸性和低氧。TME反应性CAR可通过限制CAR-T细胞的活化和分布，从而限制其靶向非肿瘤效应（图3Eg），如低氧诱导高表达而正常氧介导降解的CAR、pH敏感CAR-T细胞，但上述细胞仍可对生理性低氧组织和酸性组织造成损害，需要进一步改善其特异性。
4.6 其他膜蛋白相关CAR
很多膜蛋白经过修饰后可增强CAR-T细胞功能（图3Eh）。如IL-2/IL-2Rβ CAR-T系统杜绝了IL-2的非特异性活化，减少了副作用；二代CAR-T细胞的胞内区引入IL-2Rβ和STAT3结合基序，可增强细胞因子介导的活化信号，增强其增殖和抗肿瘤作用；通过细胞因子与配体结合增加CAR-T细胞归巢和肿瘤浸润，也是增强CAR-T细胞作用的策略，但对特异性要求较高；阻断对CAR-T细胞具有抑制性作用的信号或将抑制性信号转化为活化信号，均可增强CAR-T细胞作用；表达CD40配体的CAR-T细胞既可杀伤表达CD40的肿瘤细胞，还可活化抗原递呈细胞（APC），增强内源性免疫细胞的抗肿瘤作用，减少免疫逃逸；将CAR-T细胞的胞内区与光敏感元件结合，形成光开关CAR（LiCAR），抗肿瘤作用和安全性均得到改善。
4.7基因编辑CAR
利用基因编辑技术可以发展新型CAR（图3Ei），如敲除或沉默PDCD1可以增加CAR-T细胞抗肿瘤作用、制造通用型CAR-T细胞等，但依旧存在诸多技术壁垒。
研究进展
2012年CD19 CAR-T细胞治愈了一名6岁急性淋巴细胞白血病患儿，自此CAR-T细胞在血液系统恶性肿瘤治疗中取得巨大成功，截至发文，目前已有8个CAR-T细胞产品上市，包括FDA批准的Kymriah、Yescarta、Tecartus、Breyanzi、Abecma和Carvykti以及中国国家药品监督管理局批准的Carteyva 和CT103A，一些在研的CAR-T细胞治疗血液系统恶性肿瘤也取得了很好的结果。然而CAR-T细胞在实体瘤的治疗进展非常缓慢，主要源于靶特异性差和免疫抑制性TME。目前CAR-T细胞治疗实体瘤的主要靶点包括glypican-3、GD2、HER2、B7-H3和claudin18.2（图2C），疗效仍有待改善。此外CAR-T细胞在非肿瘤性疾病治疗中也有尝试，如HIV、GvHD和自身免疫性疾病。
挑战和潜在解决方案
1.靶点选择
恰当的靶点对于CAR-T细胞是首要需考虑的问题，目前关于靶点选择主要存在如下问题：（1）可用靶点少；（2）抗原刺激敏感性差；（3）特异性不足，对正常组织造成损伤。逻辑门控CAR-T细胞可部分克服特异性不足（图3），而溶瘤病毒（OVs）和CAR-T细胞联合治疗也可有效改善特异性不足，工程化免疫细胞池类似于TIL治疗，很有前景，但个体化的制造过程使其临床应用受限。
2.浸润
由于CAR-T细胞固有的化学趋化能力缺陷以及实体瘤致密的ECM，显著影响了其在实体瘤的浸润。增加CAR-T细胞实体瘤浸润的方法包括人工表达化学趋化因子、与OVs联合、采用分泌降解ECM酶的CAR-T细胞以及局部注射CAR-T细胞。
3.耗竭
体外过度扩增、反复肿瘤刺激以及抑制性TME均可导致CAR-T细胞耗竭，丧失抗肿瘤作用。耗竭的CAR-T细胞表现为抑制性受体上调，如PD-1、Lag3、Tim3和TIGIT，IL-2、TNF-α和IFN-γ分泌减少，代谢改变和表观遗传学改变。
克服CAR-T细胞耗竭的策略包括：（1）免疫检查点阻断为基础的策略，可改善CAR-T细胞的功能和持久性；（2）较少分化的CAR-T细胞与疗效相关，而较少分化的CAR-T细胞代谢需求较低，因此可通过增加CAR-T细胞的干细胞性、改变TME内的营养状态来改变CAR-T细胞表型；（3）表观遗传学和转录因子的不同可显著影响CAR-T细胞耗竭，因此重塑基因表达模式可改善CAR-T细胞的持久性；（4）去除骨髓来源的抑制性细胞（MDSCs）、促使CAR-T细胞表达炎症因子亦可减少耗竭、改善功能。值得一提的是MASTER技术极大缩短了CAR-T细胞生产时间、更好的保持了细胞的记忆表型、持久性亦极佳。所有上述策略均在研中。
4.抗原逃逸
CAR-T细胞对靶抗原密度低的肿瘤细胞通常无效，成为肿瘤复发的重要原因（图5A），串联CAR和增加靶抗原表达可克服这一缺陷。
图5 CAR-T和CAR-NK细胞治疗的比较
5.安全性
靶向非肿瘤效应、CRS和NT大大限制了CAR-T细胞的应用。IL-1和6的受体拮抗剂可以治疗CRS，NT的发生机制尚未完全明确，糖皮质激素只对轻度NT有效，GM-CSF抗体的治疗作用需要验证。发现更多药物、优化CAR-T细胞设计也是提高安全性的重要方法。
6.GvHD和HvGR
异基因CAR-T细胞很好的解决了自体T细胞不充足的问题，但同时也带来致死性风险或是CAR-T细胞被机体清除。通过基因工程修饰，减少CAR-T细胞免疫原性、去除GvHD和HvGR所需反应元件、使用开关药物终止CAR-T细胞作用，可改善异基因CAR-T细胞的安全性，如ALLO-715 CAR-T细胞。
Zhang P, Zhang G, Wan X. Challenges and new technologies in adoptive cell therapy. J Hematol Oncol. 2023;16(1):97. doi:10.1186/s13045-023-01492-8
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