罗蓉蓉, 石远凯, 韩晓红. 自身免疫性抗体在肝癌临床诊疗中的价值[J]. 中华肿瘤杂志, 2021, 43(11):1143-1147.
DOI: 10.3760/cma.j.cn112152-20191126-00764.
肝癌是我国病死率最高的恶性肿瘤之一，患者的5年生存率仅为12.5%，早期发现并及早治疗可提高肝癌患者的生存率。在目前临床常用的肝癌诊断方法中，血清甲胎蛋白(AFP)诊断效能仍不甚满意，而超声对小病灶不敏感，CT存在放射暴露的问题，因而亟需探索新的肝癌诊断相关标志物。在临床症状出现前，肝癌患者血清中就已存在靶向肿瘤相关抗原的自身免疫性抗体(AAB)，目前文献报道较多的有抗p53、抗胰岛素样生长因子Ⅱ信使RNA结合蛋白和葡萄糖调节蛋白等AAB。单个AAB在肝癌诊断中的特异度高，但灵敏度较低，多个AAB联合检测可提高肝癌诊断的灵敏度，AAB联合AFP检测可进一步提高肝癌的检出率。目前AAB与肝癌预后关系的研究较少，是未来需要继续探索的方向。
【关键词】肝肿瘤; 自身免疫性抗体; 诊断; 预后
肝癌病死率高达95%，大部分患者于诊断1年内死亡，这与肝癌的早期发现手段不完善有关。肝脏超声、CT及血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)检测是目前发现肝癌的主要方法，但超声对小肝癌(<2 cm)检出的灵敏度低且受操作者技能水平的影响较大，而CT检查存在辐射暴露且费用较高等问题。AFP是目前应用最广的原发性肝癌血清标志物，灵敏度为40%~65%，但对早期肝癌检出率低，约30%~40%的早期肝癌患者AFP处于正常水平。另外，AFP在一些慢性肝病和生殖系统肿瘤中也会升高，即使联合肝脏特异性的AFP异质体AFP-L3进行检测，其效能也并无提高。目前，临床上尚无与肝癌预后相关的有效分子标志物。因此，寻找有效的血清标志物，以提高早期发现肝癌、准确预测肝癌患者预后的能力，一直是肝癌领域的研究热点。
肿瘤细胞内蛋白质的结构改变、翻译后修饰异常、过表达或异位表达异常释放等可产生肿瘤相关性抗原(tumour-associated antigens, TAA)，TAA可刺激免疫系统产生肿瘤相关自身免疫性抗体(autoantibodies, AAB)。AAB作为TAA的"监视者"，可反映肿瘤的发生、进展与机体免疫状况，同时AAB为B细胞克隆性产生，且半衰期更长，因此将其作为TAA的"报告者"更易于检测。有研究显示，肝癌相关AAB在临床诊断前数月甚至数年即已出现于血清中，具有早期发现肝癌的潜在价值。同时，靶向TAA的AAB会随着肿瘤细胞生物学行为的改变发生相应变化，因而还具有监测肿瘤进展和预测预后的潜在价值。
肝癌诊断相关的AAB
目前，已报道的肝癌相关AAB超过70种，相关研究主要集中在肝细胞肝癌(hepatocellualr cancer，HCC)及亚洲人群中，这与肝癌的病理类型分布及疾病地区分布一致。单一AAB的检测方法主要是酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)，单一AAB诊断肝癌的灵敏度为10%~90%，特异度为40%~100%，不同AAB的诊断效能差异较大。研究最多的为抗p53、抗胰岛素样生长因子Ⅱ信使RNA结合蛋白(insulin like growth factor-Ⅱ mRNA binding protein, IMP)家族和抗葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 kD, GRP78)的AAB。此外，还有一些灵敏度较高的AAB，部分AAB在早期HCC诊断中表现良好。
1．抗p53的AAB：
p53蛋白是抑癌蛋白的明星分子，其含量或结构异常均可刺激免疫系统产生相应抗体。抗p53蛋白的AAB是报道得最早也是最多的肝癌相关AAB之一。有研究表明，抗p53蛋白的AAB与AFP浓度无关，但在AFP阳性的HCC患者中阳性率较高(83.3%)，联合AFP检测可提高检出率，可辅助AFP诊断HCC，但抗p53的AAB广泛存在于多种肿瘤中，缺乏肝癌特异性。
2．抗IMP家族的AAB：
IMP家族包含IMP1、IMP2/p62和IMP3/Koc，主要参与mRNA的转运和瞬时储存，影响多种肿瘤相关蛋白的翻译及HCC细胞基因组的稳定性，在细胞恶性转化过程中高度表达，使得血清中可检测到相应的AAB。其中，抗p62的AAB是从HCC患者中通过血清学筛选互补DNA表达文库(serological analysis of re-combinant cDNA expression libraries，SEREX)技术分离而来，仅特异性出现在HCC中，在慢性肝病中检测不到，而抗Koc的AAB则广泛存在于肝癌、卵巢癌和肺癌患者血清中。Dai等报道，76例HCC患者中，抗IMP1、p62和Koc的AAB阳性率依次为11.8%、17.8%和15.8%，这与Zhang等在75例HCC患者中检测到的抗p62和抗Koc的AAB的阳性率(10.7%和17.3%)相近，但同类AAB(抗p62和抗Koc)联合检测的灵敏度仅略有提升(24%)，这提示同类TAA激发的机体免疫反应可能较为类似，因而同类AAB联合时起到的互补以提升诊断效能的作用不大。
3．抗GRP78的AAB：
GRP78属于热休克蛋白(heat shock proteins, HSP)70家族的伴侣蛋白，可促进蛋白质折叠、组装和转运，与肿瘤细胞增殖、迁移、血管生成和化疗耐药有关。Shao等在76例肝癌患者中检测到高水平的抗GRP78抗体，其阳性率为35.5%，联合AFP检测阳性率可提高至71.4%，显著高于其在60例慢性肝病患者和86例健康人中的阳性率。而Ying等则报道，173例HCC患者中抗GRP78的AAB阳性率仅为7.5%，这可能与阳性界值的设定及健康对照的纳入标准不同有关。
4．肝癌早期诊断相关AAB：
一些AAB在早期肝癌诊断中有较好的表现。在70例早期肝癌(巴塞罗那分期为A期)和350例对照中，抗肝细胞癌模拟多肽(HCC mimic peptide, HC1)的AAB诊断早期肝癌的灵敏度为91.4%，特异度为83.1%，与肝炎及肝硬化鉴别诊断的准确度分别为83.5%和87.1%，具有良好的临床应用前景。在106例早期肝癌(巴塞罗那分期为0期和A期)和388例对照中，抗中心体蛋白F(centromere protein F，CENPF)、抗HSP60和抗p62的AAB诊断早期肝癌的受试者工作特性曲线下面积(area under curve, AUC)分别为0.826、0.764和0.796，其中抗CENPF的AAB与AFP联合诊断早期肝癌的AUC为0.882，灵敏度为86.7%，特异度为68.8%，抗CENPF的AAB在AFP阴性的HCC中阳性率达73.6%，提示其可能是发现AFP阴性早期肝癌的良好标志物。
5．其他肝癌相关AAB：
单个肝癌AAB的阳性率一般较低(10%~30%)，但也有一些阳性率较高的AAB。在31例HCC和76例对照中，抗精子相关抗原(anti-sperm associated antigen, SPAG9)的AAB诊断HCC的灵敏度和特异度可达到71.0%和87.3%。但该研究样本量较小，结论还有待进一步验证。在102例HCC和98例健康对照的研究中，抗剪接因子3B亚基1(splicing factor 3b subunit 1, SF3B1)的AAB诊断HCC的灵敏度为73.53%，联合AFP检测灵敏度可提高至87.35%，特异度达90.59%。但该研究未设置慢性肝病对照组，可能会造成特异度的过高估计。
总体而言，不同研究间样本量相差较大，且部分研究的对照组设置不严格，这些因素都可能导致同一AAB在不同研究中的诊断效能存在较大差异。
AAB组合对肝癌的诊断价值
近年来，随着血清蛋白质高通量检测技术的发展，利用多种TAA同时筛选多个AAB成为该领域的研究主流。精细选择多个AAB进行组合检测可相互弥补单个AAB阳性率偏低的不足，将肝癌检出率提高至40%以上。
合理的AAB组合不仅具备更强的发现早期肝癌的能力，建立AAB组合的诊断模型还可预测肝癌的发生。在76例HCC患者和89名健康对照中，14种AAB组合(IMP1、IMP2/p62、IMP3/Koc、CIP2A/p90、RalA、c-Myc、survivin、cyclin B1、14-3-3ζ、MDM2、p53、CAPERα/HCC1.4、p16和NPM1)获得了诊断HCC的高特异度(83.0%)和灵敏度(69.7%)，较单个AAB的阳性率(6.6%~21.1%)有了很大提高，AFP联合该组合的HCC检出率由62.8%提高至79.1%；在其中16例由慢性肝病发展而来且具有肝癌诊断前3~12个月动态血浆样本的HCC患者中，组合中的任一AAB在患者诊断前的血浆中即呈阳性，尤其是在肝癌诊断前1年，AAB组合阳性率高达87.5%。Middleton等纳入96例HCC患者，以116例慢性肝病患者和96名健康人作为对照，经过41、21、12和10种AAB不同组合的尝试，最后确定了21种AAB组合(抗H-RAS-1、p16、Gankyrin、NY-ESO-1、Sui1、p53、RalA、cyclinB1、HCC1、WT1-n-term、CK8、AFP、β-Catenin2、β-HCG、HDGF、Calreticulin、GRP78、FASN、GPC-3、DKK1和l-myc-2)联合诊断肝癌的效能最好(灵敏度为43%，特异度为88%)，较单个AAB的灵敏度(0~10%)有较大提高。另外，在16例早期HCC(巴塞罗那分期为A期)患者中，21种AAB组合的阳性率为50.0%，在其中11例具有诊断前血清的患者中，12种AAB组合的阳性率为63.6%，阳性AAB最早可于诊断前5年检出。Koziol等以160例HCC患者和90名健康人为训练集，基于5个AAB组合(抗HCC1、p16、p53、p90和survivin)，通过最小风险贝叶斯决策分析建立了诊断分类器模型，以另外17例HCC患者临床诊断前的血清进行验证显示，该分类模型可成功预测其中16例患者的肝癌发生。上述研究表明，经优化的AAB组合在HCC诊断或早期诊断中具有重要意义，较单个AAB的灵敏度高，但不同AAB组合中AAB组成差异较大，诊断性能也存在差异。
AAB在肝癌疗效预测中的价值
AAB与恶性肿瘤进展的关系依赖于具体AAB的特性。有的AAB可通过补体依赖或抗体依赖细胞介导的细胞毒作用增强T细胞或抗原提呈细胞的功能，干扰肿瘤细胞配受体的结合，影响下游信号转导，从而发挥抑制肿瘤进展的作用。有的AAB却能够促进肿瘤的进展，但具体机制尚不明确。有研究表明，当AAB由非淋巴细胞(如恶性转化的上皮细胞及上皮干/组细胞)分泌时，可能促进细胞增殖、肿瘤侵袭及转移。在前列腺癌中发现的抗GRP78的AAB靶向细胞表面的GRP78蛋白，能通过组织因子依赖性机制激活未折叠的蛋白应答，并诱导肿瘤细胞增殖。肝癌中也有高水平的抗GPR78 AAB，可能发挥类似的作用，但目前尚缺乏AAB促进肝癌进展的机制研究。
目前，肝癌复发、转移及预后相关AAB的研究较少，仅有抗GRP78、p53、骨桥蛋白(osteopontin, OPN) AAB的报道。研究显示，抗GRP78的AAB与HCC的临床分期、门静脉侵犯及转移有关，其含量在肝切除术后1周下降，但在1个月后复发的患者中又升高，提示其可能是潜在的HCC复发与转移的标志物。多项研究均显示，抗p53的AAB与肝癌的不良预后密切相关。OPN作为一种磷酸化和糖基化的蛋白在肝癌组织中高表达，在肝细胞癌变及转移中起重要作用。Meta分析表明，血清OPN蛋白水平升高预示肝癌预后较差。Ying等报道，肝癌组织中高表达的OPN蛋白可分泌至血清中引起抗OPN的AAB含量上升，抗OPN的AAB可作为预测肝癌预后的潜在生物标志物。
肝癌AAB研究展望
寻找肝癌早期诊断、监测进展、预测治疗反应的无创生物标志物一直是肝癌研究的焦点。AAB与肝癌的发生发展密切相关，是除了循环肿瘤细胞、循环肿瘤细胞DNA、血清TAA之外的另一重要血清分子标志物，具有诊断及早期诊断的价值，一般AAB组合较单个AAB诊断特异度稍有下降，但灵敏度有较大提高，同时AAB联合AFP检测可进一步提高检出率，弥补了AFP对小肝癌及早期肝癌灵敏度低的不足。
尽管肝癌领域AAB的研究已近20多年，但一直未取得重大突破，可能主要有以下原因：(1)早期的研究多为回顾性小样本研究，样本量小使结果具有偶然性，而回顾性研究比前瞻性研究干扰因素更多。另外，研究中对照的设置欠严谨，如健康对照未与肝癌患者进行性别、年龄匹配，未设置肝炎或肝硬化等前驱疾病对照，因而可能使非研究因素带来的偏倚增加，这也是导致同一AAB在不同研究中差异较大的主要原因。(2)恶性肿瘤相关免疫诊断的问题之一是TAA的定义，尤其对于肝癌这一具有明确前驱疾病的肿瘤，在其诊断相关性AAB的横断面研究中，将患者诊断时血清中出现的所有细胞抗原均定义为TAA是不合理的，有的TAA在良性疾病中已经存在，这提示明智地选择AAB组合对提高特异度十分重要，也再次说明了设置前驱慢性肝病对照的必要性。(3)某一横断面的AAB只反映当下TAA的信息，分析肝癌诊断或治疗前后的AAB的动态变化，即构建时序性AAB表达谱可提供更多临床疾病变化的有用信息，但目前这类研究较少且含动态血清的样本量也较小。(4)目前，单个AAB阳性的界值有多种界定方式，最常见的是以健康对照组AAB水平的均数和标准差界定，即高于健康对照组AAB均数+2(或3或4)倍标准差为界值。对于偏态分布数据则以健康组AAB的95%分位数(P95)为界值。还有的研究以健康对照组AAB吸光度值的2倍为界值。针对AAB组合，多是以任一AAB阳性为结果阳性(并联判断)，但易出现假阳性的问题。若以组合中所有AAB均为阳性方为结果阳性(串联判断)，也存在灵敏度低的问题。(5)从细胞病理类型来看，目前的肝癌AAB研究主要集中在HCC，对于胆管细胞癌和混合型细胞癌研究很少。从病因角度而言，AAB与乙肝或丙肝病毒感染所致肝癌的研究较多，而酒精性肝癌、自身免疫性相关肝癌中靶向TAA的AAB则鲜有报道。
未来肝癌AAB领域的研究，在继续寻找新的具有高诊断价值和预后评估价值AAB的同时，也应注重AAB组合的临床转化，要开展更多大样本的前瞻性临床研究以明确AAB的临床应用价值。针对慢性肝病患者等肝癌高危险人群，开展AAB水平的动态监测，并结合临床病理特征评估AAB在肝癌的诊断和预后预测中的贡献程度，构建多因素的诊断模型和疗效预测模型，这将有利于全面真实地反映肝癌的发生及进展情况，对于肝癌的早诊早治具有重要意义。
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