解修峰, 孙艳, 赵晓航.肝细胞癌尿代谢组学初步研究[J]. 中华肿瘤杂志, 2022, 44(3):252-259.
DOI: 10.3760/cma.j.cn112152-20200825-00765.
目的
探讨肝细胞癌(HCC)患者尿液小分子代谢物及其代谢特征。
方法
采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术分析健康人群(n＝10)、肝血管瘤患者(n＝10)和HCC患者(n＝10)尿液中的小分子代谢物。采用正交偏最小二乘法-判别分析和层次聚类分析以及单因素分析等方法分析全组人群的尿液代谢物产物差异。
结果
全组人群中，差异代谢物381种，其中上调的代谢物96种，下调的代谢物285种。与HCC有关的特异性尿液代谢物55种，包括21种上调的代谢物，如Acetyl-DL-Leucine、Ala Asp、HoPhe-Gly-OH等，以及34种下调的代谢物，如Selenocystathionine、Met Trp Met Cys、Valsartan acid等。京都基因与基因组百科全书通路分析显示，差异代谢物主要富集于谷氨酰胺/谷氨酸代谢、赖氨酸生物合成、三羧酸循环和嘌呤代谢等通路。
结论
HCC发生过程中伴随多种代谢物和代谢途径改变，分析HCC患者尿液的特征代谢谱，有助于发现肝癌的代谢标志物和潜在的治疗靶点。
【关键词】肝肿瘤; 尿代谢组学; 无创诊断; 生物标志物
原发性肝癌是世界上常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率分别位居恶性肿瘤的第7位和第2位。中国肝癌发病率为18.3/10万，中国肝癌患者总数居世界第1位。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是肝癌的主要类型，约占肝癌的75%以上。由于发病隐匿、发展迅速、恶性程度高和预后差等特点，HCC严重危害我国人民的健康。目前，HCC的诊断主要依赖于甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)血清学检查、穿刺活检和影像学检查，但AFP的灵敏度和特异度较低，约30%的HCC患者AFP为阴性。因此，寻找与HCC发生发展、预后以及疗效相关的分子标志物和研究HCC的无创或微创筛查方法，对肝癌的诊断和治疗以及提高患者治愈率具有重要意义。液体活检技术的出现一定程度上弥补了传统检测技术的弊端，为恶性肿瘤的早发现早治疗提供了新的技术手段。尿液由于其非侵入性的获得方式、取材简便、样本量大和稳定性高的特点，是液体活检的重要材料。代谢组学作为一种研究内源性代谢产物的系统方法，具有高灵敏度和高特异度，能够发现和筛选肿瘤标志代谢物和代谢途径，对辅助肿瘤诊断和发病机制的研究具有重要价值。目前，广泛应用于代谢组学研究的核心技术包括核磁共振技术、质谱(mass spectrometry, MS)、高效液相色谱(high-performance liquid chromatography, HPLC)和其他色谱-MS联用的分析技术，如气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)和液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)。由于代谢物的种类繁多且浓度差异较大，所以代谢组学的研究需要借助高灵敏度、高通量且高分辨率的分析技术来完成，而LC-MS联用技术克服了这些难点成为代谢组学研究中最常用的研究技术。为了从尿液样本中快速获得更多种类的代谢物，超高效液相色谱(ultra-performance liquid chromatography, UPLC)技术与传统的HPLC技术比较，可以增加分析样本的通量、灵敏度和色谱峰的容量，结合高精确度和高分辨的四极杆飞行时间质谱(quadrupole time-of-flight mass spectrometry, Q-TOF-MS)技术，有助于快速检测并鉴定更多的代谢物。本文研究中，我们采用UPLC-Q-TOF-MS技术开展了健康人群、肝脏血管瘤和HCC患者间差异代谢组学的研究，以便发现HCC患者特异性的尿代谢标志物和代表性的代谢通路，辅助HCC的无创诊断。
1．主要试剂：
甲醇、乙腈、乙酸铵和氨水均为分析纯以上级别，购自德国CNW Technologies公司，L-2-氯苯丙氨酸(纯度≥98%)购自上海恒柏生物科技有限公司。
2．样本来源：
人体尿液样本均来自中国医学科学院肿瘤医院，健康对照组(n＝10)中，男7例，女3例，年龄40~60岁，中位年龄为54岁；肝血管瘤组(n＝10)中，男、女各5例，年龄32~63岁，中位年龄为46岁；HCC组(n＝10)中，均为男性，年龄37~74岁，中位年龄为55岁。全组人群临床特征见表1。本研究获得中国医学科学院肿瘤医院伦理委员会审批通过(批准号：2018-768)，研究符合《赫尔辛基宣言》的原则。
3．样本采集：
采集全组人群清晨中段尿，分别收集于无菌的15 ml离心管中，每管尿量约为10 ml。离心后取上清，于-80 ℃保存备用。
4．样本处理：
移取100 μl尿液样品，加入400 μl提取液(甲醇：乙腈＝1∶1，含内标2 μg/ml)，涡旋混匀30 s，冰水浴超声10 min，-40 ℃静置1 h。尿液样品4 ℃下10000 r/min离心15 min，离心半径为12.5 cm，取上清400 μl于离心管中真空干燥。加入200 μl 50%乙腈复溶，涡旋30 s，冰水浴超声10 min。样品4 ℃下10000 r/min离心15 min，离心半径为12.5 cm，取75 μl上清液于进样瓶中上机检测，所有样品另取10 μl上清混合成质量控制样品上机检测。
5．样本分离和质谱检测：
使用ExionLC(美国Scientific Export公司)超高效液相色谱仪，通过Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱A相为水相，含25 mmol/L乙酸铵和25 mmol/L氨水，B相为乙腈。采用梯度洗脱：0~0.5 min，95% B；0.5~7 min，95%~65% B；7~8 min，65%~40% B；8~9 min，40% B；9~9.1 min，40%~95% B；9.1~12 min，95% B。流动相流速为0.5 ml/min，柱温为25 ℃，样品盘温度为4 ℃，进样体积为正离子2 μl，负离子2 μl。使用Triple TOF 5600高分辨质谱(美国Scientific Export公司)通过信息依赖型扫描(information-dependent acquisition, IDA)模式进行高分辨质谱数据采集。在IDA模式下，数据采集软件(美国Scientific Export公司，Analyst TF 1.7)依据一级质谱数据和预先设定的标准，自动选择离子并采集其二级质谱数据。每个循环选取12个强度>
100的离子进行二级质谱扫描，碰撞诱导解离的能量为30 eV，循环时间为0.56 s。离子源参数如下，GS1：60 psi，GS2：30 psi，CUR：35 psi，TEM：600 ℃，DP：60 V，ISVF: 5000 V (Pos)/-4000 (Warburg, #165)。
6．数据处理：
使用ProteoWizard软件将质谱原始数据转成mzXML格式。使用XCMS做保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分和峰对齐等工作，minfrac设为0.5，临界值设为0.3。同时使用自撰写R程序包和自建二级质谱数据库对峰进行物质鉴定。
7．统计学方法：
采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。采用正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis, OPLS-DA)和层次聚类分析以及单因素统计分析方法测定分析相关代谢标志物。检验水准α＝0.05。
1．代谢指纹图谱宏观分析：
总离子色谱图分析显示，HCC组、肝血管瘤组和健康对照组代谢指纹图谱的峰面积、保留时间和峰强度均有差异(图1)，提示3组间代谢物丰度不同。
2．代谢谱分析：
OPLS-DA分析显示，3组人群中两两组间的代谢谱分离良好，肝血管瘤组与健康对照组、肝细胞癌组与健康对照组、肝细胞癌组与肝血管瘤组解释率分别为0.964、0.954和0.893，预测率分别为0.656、0.712和0.224(图2)。
3．肝脏病变相关差异代谢物：
本研究共得到381种差异代谢物，其中96种代谢物上调，285种代谢物下调。通过对肝血管瘤组与健康对照组和肝细胞癌组与健康对照组的差异代谢物进行筛选，鉴定到328个与肝脏良性病变相关的差异代谢物，其中55个代谢物上调，273个代谢物下调(均P<0.05，表2、表3)，差异代谢物火山图见图3。差异代谢物的京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路分析显示，差异代谢物主要富集在氨基酸代谢、生物素代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭和儿茶酚的生物合成等通路(图4)。
4．HCC特异性差异代谢物：
采用P<0.05且VIP值>1.000为卡值标准，对3组间的差异代谢物在剔除与健康对照组和肝血管瘤组共有差异代谢物之后(图5)，得到了55种与HCC有关的代谢物，其中21种代谢物上调(如Acetyl-DL-Leucine、Ala Asp、HoPhe-Gly-OH等)，34种代谢物下调(如Selenocystathionine、Met Trp Met Cys、Valsartan acid等，表4)。
HCC特异性差异代谢物层次聚类分析显示，肝细胞癌组与健康对照组的差异代谢物区分明显，与健康对照组比较，肝细胞癌组中大部分的差异代谢物均下调(图6)。KEGG分析显示，差异代谢物主要富集在氨基酸代谢、生物素代谢、组氨酸代谢和嘌呤代谢等通路(图7)。
肝癌尿液代谢组学的研究中，由于受到检测技术(如GC-MS和LC-MS等)的限制，导致鉴定出的差异代谢物较少。Dai等分别以肝硬化和健康人的尿液作为对照筛选早期肝癌的生物标志物，通过LC-MS仅检测到肝癌患者尿液中的36种类固醇激素。此外，Cox等使用核磁共振波谱法(NMR)检测乙型肝炎相关HCC患者尿液中的代谢物，与肝硬化患者和健康人群比较，HCC患者具有独特的尿代谢特征，但是，由于该研究中的标准品种类少，导致鉴定出的代谢物种类也很少，仅检测到一些普通的代谢物，如甲酸、乙酸、肌酸和甘氨酸等。有研究者使用气相色谱-飞行时间质谱技术检测手术切除后肝癌复发患者的尿代谢特征，但由于气相色谱制备费时、通量低且灵敏度低，导致检测到的脂类物质较少。传统检测技术，存在低速度、低灵敏度、低分离度和低通量的缺点，导致检测到的代谢物数量较少，不具有代表性。
在本研究中，我们采用UPLC-Q-TOF-MS技术克服了传统的LC-MS和GC-MS手段检测代谢物数目少的问题，全组人群共鉴定381种差异代谢物(包括氨基酸类、胆汁酸类、脂肪酸类和有机酸类等)，含96种上调代谢物和285种下调代谢物。与传统检测技术鉴定到的代谢物比较，本研究中，我们鉴定到了部分相同的有机酸类、胆汁酸类和氨基酸类的差异代谢物(如柠檬酸、甲酸、肌酸、胆汁酸、和甘氨酸等)，此外，我们还发现了尿液中其他的有机酸类、激素类和嘌呤类的代谢物(如缬沙坦酸、乙二胺四乙酸盐、前列腺素和6-甲硫基嘌呤等)。OPLS-DA模型在全组人群中显示出良好的分离度，提示这种分析方法在尿液代谢组学研究中具有一定优势。Sreekumar等通过GC-MS结合LC-MS分析了前列腺癌代谢组，结果显示，肌氨酸能够调节前列腺癌细胞的侵袭和迁移能力，可作为前列腺癌的诊断标志物。Alberice等的研究显示，N-三甲基赖氨酸、N-乙酰色氨酸、多巴醌、亮氨酸和次黄嘌呤这5种代谢物与膀胱癌的复发有关。代谢组学在乳腺癌和卵巢癌等多种肿瘤生物标志物的研究中发挥重要作用，尿液代谢组学分析在恶性肿瘤临床诊断中具有广阔的应用前景。近年来，人们尝试寻找比AFP更有效的生物标志物以辅助肝癌的诊断、预测预后和疗效监测。随着高通量代谢组学技术的发展，极大提升了对肝癌等疾病生物标志物的发现和验证的速度。
肝脏作为代谢活动的主要场所，在解毒、调节脂质和氨基酸的摄取以及维持代谢平衡方面发挥重要作用。有研究显示，在肥胖驱动和非酒精性脂肪性肝炎驱动的HCC中，肿瘤细胞表现出强烈的脂肪病变，由肉碱棕榈酰转移酶2下调介导的代谢重编程使HCC细胞逃脱脂毒性并促进肝癌的发生。肝脏肿瘤的发生和进展往往伴随着代谢途径的重编程，导致代谢稳态失衡，引起代谢产物的改变。近年来，肝癌患者尿液的代谢组学研究也多有报道，Dai等研究分析了HCC患者、肝硬化患者和健康对照人群的尿类固醇激素，结果显示，表睾酮和四氢皮质醇对HCC和肝硬化有很好的诊断能力，克服了AFP的敏感度和特异度较低的缺点。Shao等也分析了HCC患者、肝硬化患者和健康人的尿液代谢组学，与对照组比较，HCC组和肝硬化组中的尿核苷、胆汁酸、柠檬酸等氨基酸发生了变化，主要表现为嘌呤代谢、能量代谢和氨基酸代谢紊乱。此外，还有研究者对HCC手术切除后和HCC切除患者围手术期的尿代谢组进行分析，发现了与HCC复发相关的潜在尿代谢特征。本研究中，我们通过多种生物信息学分析方法对全组人群尿液中的代谢物进行分析，在所有的差异代谢物中剔除了与肝脏血管瘤有关的差异代谢物，得到了55种与HCC密切相关的代谢物，KEGG通路分析显示，HCC特异性的差异代谢物主要在氨基酸代谢、生物素代谢、组氨酸代谢和嘌呤代谢等通路中异常。为了更准确地筛选出HCC特异性差异代谢物，我们在人类代谢组数据库中检索了前20种HCC特异性代谢物，发现丙氨酸丁氨酸硒醚、乙酰基-DL-亮氨酸、N-氧化佐匹克隆、波森坦、6β-纳曲酮、乙炔酸M2和芽子碱在肝脏中发挥着重要作用，提示这几种代谢物有助于鉴别诊断肝癌。与既往研究报道相似的是，本研究结果显示，甲基组氨酸代谢通路在HCC患者中改变。生物素作为羧化酶的辅酶参与脂肪酸与支链氨基酸的合成，对细胞的生长具有重要作用。本研究显示，HCC患者尿液中生物素代谢通路改变，表明该途径在肝癌的发生发展中可能发挥重要作用。肿瘤细胞往往上调氨基酸代谢通路以满足其快速增殖对营养物质的需求，本研究显示，氨基酸代谢通路在HCC患者尿液中的异常改变，嘌呤代谢在HCC中的作用尚未被证实，嘌呤代谢途径在HCC尿液中发生变化，提示嘌呤代谢可能是HCC诊断和治疗的新靶点。此外，肝脏病变相关的差异代谢物与HCC特异性的差异代谢物均存在氨基酸代谢和生物素代谢途径的异常。由于肝血管瘤和肝癌都为肝脏占位性病变，早期表现相似，在临床诊断中容易混淆，本研究中，我们通过尿液代谢组学分析显示，虽然肝脏血管瘤和HCC都能引起很多尿液代谢物改变，但仍然能筛选出与HCC有关的特异性代谢物，通过鉴定肝血管瘤和肝细胞癌的尿液代谢物，希望能为肝脏良恶性肿瘤的区分和诊断提供帮助。
本研究有局限性。(1)样本量较少，可能会影响检测结果的准确性；(2)大多数的肝癌患者都伴有肝炎和肝硬化，有研究显示，HCC患者、乙型肝炎肝硬化和慢性乙型肝炎患者的尿液代谢物，鉴定出乙酸盐、肌酸、肌酸酐、二甲胺、甲酸盐、甘氨酸、马尿酸盐和三甲胺-N-氧化物等代谢物。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染是HCC的主要原因，本研究纳入的HCC患者全部为HBV携带者，均为HBV相关HCC。但是我们的研究没有涉及病毒性肝炎和肝硬化阶段的代谢物改变，鉴定到的差异代谢物仅与肝脏良恶性肿瘤相关，不能提示肝硬化和早期肝癌的改变。未来的研究中还需在更大的肝癌队列中，利用非靶向代谢组学和靶向代谢组学深入表征HCC的尿代谢组学特征。
综上所述，本研究通过对健康人群、肝血管瘤患者和HCC患者的尿液代谢组的研究，初步确定了与肝癌相关的尿液代谢标志物及其代谢通路的变化。在下一步的研究当中需要进一步验证某一种或者几种差异代谢物在肝炎、肝硬化和HCC患者尿液中的富集情况，为HCC的诊治提供代谢水平的标志物。总之，尿液代谢组学分析方法将在恶性肿瘤的诊断和靶向治疗方面发挥越来越重要的作用。
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