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【35under35】刘赟医生：解析神经母细胞瘤骨髓转移分子特征和演化进程的研究

2023年08月23日

作者：刘赟

医院：天津医科大学肿瘤医院

刘赟

主治医师、讲师、肿瘤学博士

天津医科大学肿瘤医院儿童肿瘤科
国家儿童肿瘤监测中心血液病、恶性肿瘤青年委员会委员
中国抗癌协会小儿肿瘤专业委员会第四届青年委员会委员
天津市河西区青年联合会第八届委员
主持国自然青年基金1项，作为课题骨干参与国家科技部重点研发计划项目1项，参与国家自然科学基金面上项目1项。以第一作者在Nucleic Acids ResearchCancer Research Cell DeathandDisease等杂志发表SCI4篇，累积影响因子34分:在中文核心期刊发表1篇:参与发表SCI12篇:参与撰写神经母细胞瘤共识指南等。
主要研究方向儿童实体肿瘤的综合治疗。

神经母细胞瘤（Neuroblastoma，NB）是一种胚胎发育相关的罕见恶性肿瘤，最大特点在于其肿瘤复杂的生物学特性导致的临床表现多样性，是儿童肿瘤中最难治的一种疾病。NB常发生的转移部位见于骨髓（71%）、骨骼（56%）和淋巴结（31%）^[1]，伴骨髓转移的高危NB患儿，即使使用高强度、多种手段（手术、化疗、放疗、自体外周血干细胞移植及免疫治疗）联合治疗，也很难完全控制治疗后骨髓转移的复发^[2]，成为该病进展和治疗失败的主要原因，但人们对于NB骨髓转移方面的认识至今仍很局限，因此，研究NB骨髓转移的潜在因素和机制，对早期识别骨髓转移的风险，进行早期临床干预，具有重要的研究和临床价值。

NB基因分子特征明显区别于成人肿瘤，具有儿童肿瘤的普遍特点。国外研究揭示了NB具有两种相对常见的遗传改变，一是具有较低的外显子突变频率和较少的高频突变基因，二是点突变和结构/拷贝数变异是NB的驱动因素。研究明确了NB常见发生变异的基因为ALK（占全部样本的7%）和TIAM1（3%），约20%存在位于2p24染色体上的MYCN基因扩增，扩增程度与肿瘤晚期、不良生物学特征及预后不良密切相关^[3,4]。但这些发现也只能解释NB肿瘤少部分生物学行为，已经发现的分子特征，明显存在与临床表现和已知分子标志物的不匹配，这意味着NB的研究，需要找到更适合的与成人肿瘤研究不同的突破点。一个包括38种恶性肿瘤的2658个样本的全基因组研究显示，95.1％样本有明显的亚克隆扩展证据，且亚克隆之间存在分支进化关系^[5]。大部分NB肿瘤存在亚克隆，研究NB亚克隆演化过程，有利于解释肿瘤异质性所致的肿瘤不同临床表现，解决肿瘤异质性造成的治疗瓶颈问题。因此，我们课题组前期从NB原发、转移灶全基因组测序数据中关注亚克隆事件，分析亚克隆驱动突变事件，亦是期望能够描述NB骨髓转移的演化过程和特性。

骨髓转移是NB具有的临床特点，也是影响NB预后的关键因素，同时骨髓转移灶也是反映NB亚克隆进化的合适研究模型，有助于揭示NB骨髓转移的演进过程。

据报道，固有的迁移神经嵴细胞具有很高的远处移动的潜力，NB是神经嵴细胞发育分化失败的结果，这些交感-肾上腺谱系的神经嵴细胞在胚胎发育过程中，从神经管的背侧部分出现，并通过一个模式化的腹侧迁移到达交感区域^[6]，当胚胎细胞分化迁移过程中受到不良影响，即有可能形成肿瘤和发生细胞异常迁移。另一研究显示，恶性肿瘤的转移灶起源于原发肿瘤中的单个细胞、单个克隆或多个克隆，但是人们对于这些模式在不同肿瘤中的普遍性仍知之甚少^[7]。尽管有研究在基因组学层面，对没有匹配的NB原发灶和NB转移灶分别进行了表征，但其结果无法达到同一病人配对原发灶和转移灶研究的价值。随着基因组学技术的不断发展，基因突变的逐渐积累被认为是NB肿瘤发生、转移的主要原因，但目前仍未见NB原发、骨髓转移灶演化进程的系统性分析结果。在国际上对NB骨髓转移的研究相对进展缓慢，也是因为骨髓转移标本存在难发现、难取样、样本量少等特点。因此，对同一患儿原发灶和骨髓转移灶进行系统比较分析，应该是研究NB原发及转移灶亚克隆演化进程的良好模型。

我们课题组前期构建了NB骨髓转移队列和多组学数据库。我们在完成匹配原发灶和骨髓转移灶的NB患儿中进行了基因组学探究，并对驱动NB骨髓转移的驱动因素有了新认识。我们进一步通过进化分析发现NB的骨髓转移具有不同的模式，分为两类：一类模式是伴随着发育而分离，进而在各自部位发展为肿瘤。这类模式下，异质性比较高。另外一种模式是原发肿瘤形成后，一部分原发肿瘤的细胞从原发部位转移到转移部位，原发和转移肿瘤具有较高的一致性。但受限于样本数目、全基因组测序深度等技术原因，前期结果不足以精确追踪各个病灶的亚克隆结构的演化过程，也不足以准确重构NB骨髓转移的演进过程，包含其转移的来源、转移路径和转移时间节点等。

因此，本课题计划进一步阐明上述问题，我们拟利用前期课题组已构建的NB骨髓转移队列和多组学数据库，增加NB原发灶及其配对骨髓转移灶样本，利用单细胞全基因组测序技术，通过在单个细胞水平上对基因组分子特征进行分析，揭示单个细胞的基因结构和突变状态，解决NB肿瘤高异质性的一些干扰，实现低丰度突变检出的可能。同时与课题组前期全基因组测序的结果进行联合对比分析，通过识别体细胞突变的数量及变异等位基因频率，分析亚克隆的组成来追踪亚克隆进化，分析肿瘤异质性和克隆结构，确定NB骨髓转移灶的亚克隆结构和对应的驱动基因突变和拷贝数变异；同时重构转移肿瘤细胞亚克隆的演化进程。再基于其亚克隆演化进程，推断NB骨髓转移产生的起源和时间，探究NB可能的不同类型骨髓转移的驱动分子事件和转移规律。最终达到早期识别骨髓转移的风险，并开展早期临床干预，改善患者预后提供依据。

构建基于多组学联合分析的NB骨髓转移的分子特征谱，鉴定并验证关键驱动基因，为NB诊疗的提供干预策略。

各组学分析中的样本解析和数据完成度会存在一些差异，但也具有一定的互补性，多组学联合分析因此具有一定的优势。单细胞多组学分析的实验技术和数据分析方法，对于确保研究中重要分子在不同组学层次间更准确的调控关系至关重要。这些调控关系可以在单细胞水平上提供新的见解，这一点通过综合分析多组学数据得到了证明。单细胞转录组（scRNA-seq）可解决组织块转录组（bulk-RNAseq）的平均化效应，组织块转录组虽然掩盖了部分表达特征，但是相对成本较低，技术成熟度高，所以两个组学联合分析可以达到相互验证的效果^[8]。

本课题计划增加有效病例，合理样本队列，分别对同一病人的原发灶、骨髓转移灶的单个细胞基因组和转录组分别进行测序，以期完成细胞分型和标记因子的鉴定，实现对细胞群体的划分，从而弥补常规测序分析的局限性，解决Bulk转录组测序无法解决的细胞异质性问题，具有细胞通量高、建库成本低、捕获周期短等优势。通过应用多组学联合比对分析，实现表达差异的检测，探究发现新的细胞类型，预测细胞分化与研究发育轨迹，为阐明NB骨髓转移的演化规律，起到重要的作用。

图片16.png 图1:研究内容总体示意图

参考文献

[1] Teitz T, Inoue M, Valentine MB et al. Th-MYCN mice with caspase-8 deficiency develop advanced neuroblastoma with bone marrow metastasis. Cancer Res. 2013 Jul 1;73(13):4086-97.
[2] Mlakar V, Jurkovic Mlakar S, Lopez G et al. 11q deletion in neuroblastoma: a review of biological and clinical implications. Mol Cancer. 2017 Jun 29;16(1):114.
[3] Molenaar JJ, Koster J, Zwijnenburg DA et al. Sequencing of neuroblastoma identifies chromothripsis and defects in neuritogenesis genes. Nature. 2012 Feb 22;483(7391):589-93.
[4] Matthay KK, Maris JM, Schleiermacher G et al. Neuroblastoma. Nat Rev Dis Primers. 2016 Nov 10;2:16078.
[5] Dentro SC, Leshchiner I, Haase K et al. PCAWG Evolution and Heterogeneity Working Group and the PCAWG Consortium. Characterizing genetic intra-tumor heterogeneity across 2,658 human cancer genomes. Cell. 2021 Apr 15;184(8):2239-2254.
[6]Ratner N, Brodeur GM, Dale RC et al. The "neuro" of neuroblastoma: Neuroblastoma as a neurodevelopmental disorder. Ann Neurol. 2016 Jul;80(1):13-23.
[7] Hu Z, Li Z, Ma Z et al. Multi-cancer analysis of clonality and the timing of systemic spread in paired primary tumors and metastases. Nat Genet. 2020 Jul;52(7):701-708.
[8] Lee J, Hyeon DY, Hwang D. Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods. Exp Mol Med. 2020 Sep;52(9):1428-1442