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【35under35】朱昆鹏医生：非编码RNA在骨肉瘤精准治疗中的潜在临床应用探索---聚焦长链非编码RNA和环状RNA

2023年08月22日

作者：朱昆鹏

医院：同济大学附属上海市第十人民医院

朱昆鹏

主治医师

同济大学附属上海市第十人民医院骨科
医学博士
同济大学医学院高等研究院副研究员
中国医师协会骨科分会会员
上海市青年科技人才协会会员
CSCO会员
上海市抗癌协会会员
上海市解剖学会会员
研究方向: 骨与软组织肿瘤的保肢及功能重建相关临床与基础研究
2017年度上海医学科技奖三等奖
2018年《中华骨科杂志》论坛优秀论文二等奖
2018年上海市中西医结合学会骨伤科专委会基础研究论文大赛二等奖
2019全国骨肿瘤学术大会中青年优秀论文三等奖
2019上海市骨科学术年会优秀论文二等奖
2019 第十四届COA国际学术大会 “中青年优秀论文大赛”
2021年上海市第十人民医院“科技新人”、“国自然贡献奖”
2022年上海市第十人民医院 “青年岗位能手”、“先进医务工作者”
2023上海市骨科年会优秀论文三等奖
近5年，第一、共一或通讯作者发表SCI 论文15 篇，IF>10有5篇，累计影响因子IF>90分
另有1篇中华系列论文发表

近二十年，骨肉瘤的治疗进入了瓶颈期，这可能与化疗耐药和肺转移骨肉瘤的治疗效果难以突破有关，骨肉瘤目前的临床诊治主要面临以下几大问题：（1）骨肉瘤的诊断仍主要依赖临床+影像+病理三结合的模式，目前尚缺乏特异性的生物标志物，可通过简单易操作的无创液体活检的方法进行骨肉瘤的诊断、监测疾病进展以及判断患者的预后，比如ctDNA、CTC、cfDNA等等；（2）骨肉瘤化疗多药耐药及肺转移的分子机制及相应的治疗策略是目前的临床难点，目前针对化疗耐药，常采用更换二线化疗、变更或增加分子靶向药物及免疫治疗药物，而基因二代测序、PDX和类器官PDO模型的临床应用，为治疗药物的选择提供了指引方向，但是也有费用高、周期长、假阳性等问题；（3）骨肉瘤保肢功能重建的各种新型术式方法的比较和并发症防治。

我所在的科研团队，目前的主要科研领域聚焦于非编码RNA与骨肉瘤，重点关注长链非编码RNA和环状RNA。非编码RNA是一类不具有编码能力RNA分子，它的数量巨大，根据长度的不同，可分为短链非编码RNA，例如miRNA和长链非编码RNA，例如lncRNA等等。非编码RNA是一类重要的调控性分子，属于比较上游的分子，它的最重要的作用机制是通过调控下游重要的基因或者靶分子的功能来实现的，而且往往靶分子和基因数目众多，因此非编码RNA作为肿瘤的直接治疗靶点可能不是最佳的治疗选择。但是非编码RNA有其自身的一些特点，它不同于普通的线性mRNA，它由于特殊的空间二级或三级结构，具有较好的稳定性，不管是lncRNA还是circRNA，都可以相对稳定的存在，而且它只需要采用qPCR即可进行检测，简单易操作，可作为理想的生物标志物的候选分子，辅助骨肉瘤的诊治和预后判断。

我们的科研方向主要是非编码RNA在骨肉瘤化疗耐药和侵袭转移中的生物学作用和分子调控机制。前期我们通过采用高通量lncRNA芯片检测和RNA二代测序技术，在国际上率先报道了骨肉瘤多药耐药细胞株中的lncRNA、circRNA和ceRNA的表达谱(Molecular Therapy.2019;27(3):518-530、Epigenomics.20 18;10(10):1327-1346)，并发现在耐药细胞中高表达20倍的lncRNA FOXC2-AS1可以通过序列互补所形成的RNA-RNA双链结构，保护其共轭基因FOXC2的mRNA免受RNA酶降解，促进转录因子FOXC2的表达，从而促进经典耐药相关基因ABCB1的高表达，导致骨肉瘤阿霉素耐药的发生（Cancer Letters.2017;396:66-75）；并进一步发现lncRNA FOXC2-AS1可通过miR-3182/MMP2和miR-6874-3p/IL-6分子轴促进骨肉瘤的侵袭和转移（Molecular Therapy.2017;25(10):2383-2393、Exp Cell Res.2022;412 (2):113050.）我们根据其功能将其命名为lncRNA ODRUL，并已被NCBI的GeneBank数据库所收录（https://www. ncbi. nlm.nih.gov/ gene/103752587）。此外先后发现lncRNA FOXF1-AS1（Int.J.Biol.Sci.20 17;13(9):1180-91.）、lncRNA OIP5-AS1（J Cell Physiol.2019;234(5):6927-39.）以及circPVT1（Int.J.Biol.Sci. 2018;14(3):321-30）、circHIPK3（Journal of Cancer. 2018; 9(10):1856-62.）、circ_0081001（Int.J.Biol.Sci.2018;14 (1 1):1513-20.）、circ_0004674（Cell Death Discov.2021;7(1):309.）在骨肉瘤发生、发展以及耐药、转移中的作用和分子调控机制，发现lncRNA ODRUL、circPVT1以及circ_0081001、circ_0004674可能作为骨肉瘤诊断和预后判断的生物标志物，从lncRNA和circRNA的角度，补充完善了骨肉瘤发生、发展的分子机制。目前以第一、共一或通讯作者共发表相关SCI论文17篇（含4篇ESI高被引论文），中华系列论文3篇，其中包括Molecular Therapy、Cancer Letters、International Journal of Biological Sciences等肿瘤研究领域的知名期刊，IF>10分有5篇，累计影响因子超过90分，已累计被引用800余次，学术成果获得业内学者肯定。此外，近3年共主持国自然、上海市科委、卫健委等科研项目6项，获批国家专利3项，参编骨肿瘤相关中英文专著《Sarcoma》和《腓骨移植重建外科技术》，先后获得上海医学科技奖、上海市优秀毕业生、全国骨肿瘤学术年会优秀论文三等奖、上海市骨科学术年会优秀论文二等奖、上海市中西医结合学会骨科分会基础研究论文大赛二等奖、《中华骨科杂志》论文优秀论文二等奖等荣誉。

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图1.我们前期发现的与骨肉瘤恶性进展密切相关的非编码RNA

此外，基于前期基础研究的成果，我们进一步开展了有关的临床研究工作，促进研究成果的潜在临床转化。环状RNA虽然具有稳定性高、检测方法简单等作为理想生物标志物的优点，但是由于环状RNA本身在血清中的分子浓度较低，对其检测的技术要求相对较高，普通PCR的检测精度不够，误差较大，难以满足临床应用的需要。为此，我们采用数字微滴式PCR（Droplet Digital PCR，RT-ddPCR）技术来解决这一临床难题，它是第三代 PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）技术，是一种对核酸分子进行绝对定量的方法。ddPCR的原理是在PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。ddPCR灵敏度非常高，且只需要很少的模板量；尤其适用于痕量、不易得到的待检样品；弥补了第二代 PCR 系统难以精确测定基因拷贝数、无法对痕量突变定性和定量、精确度低等缺点。满足更多临床检验的需求，更精确，更数字化,非常适合一些稀有样本中核酸的精确检测，用于肿瘤的早期筛查、肿瘤继发性耐药检测及肿瘤负荷实时监控等。前期已有多篇ddPCR技术可精准检测包括肺癌、前列腺癌、口腔癌等多种肿瘤患者血清及组织中环状RNA表达的文献报道。

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图2.数字微滴式PCR的优势特点介绍

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图3.研究总体设计和流程图

我们采用标本要求量少、灵敏度更高的实时数字微滴式PCR（RT-ddPCR）技术，收集骨肉瘤患者各个诊治阶段的外周血和肿瘤组织标本，动态检测外周血中新环状RNA circ_0004674和circ_0081001的表达水平，并与患者的临床信息（肿瘤大小、分期分级以及肿瘤化疗敏感性、复发、肺转移等）作相关性分析，结合骨肉瘤传统生物标志物碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）的表达水平变化，通过前瞻性研究的实验设计，进一步明确circ_0004674和circ_0081001对骨肉瘤化疗耐药及肺转移的早期辅助诊断价值，为骨肉瘤的早诊早治及预后判断提供更加可靠的生物标志物，也为相关生物标志物试剂盒的研发积累宝贵数据和经验，奠定坚实基础。目前该项课题已获得上海市卫健委临床研究专项青年项目的资助，并已申请发明专利1项（一种骨肉瘤生物标志物环状RNA-circ_0081001及其应用、申请号：ZL202210850470.1、张春林、朱昆鹏、马小龙、胡剑平）。