黄倩蕾, 赵冉冉, 杨冰玉, 等. 初诊多发性骨髓瘤的代谢轮廓及其代谢通路[J]. 中华肿瘤杂志, 2022, 44(12):1369-1375.
DOI: 10.3760/cma.j.cn112152-20201212-01066.
目的
探讨初诊多发性骨髓瘤(MM)的代谢物轮廓和代谢通路。
方法
收集2016—2017年苏州大学附属第一医院初次确诊MM患者(55例)的血清，收集年龄性别匹配的健康人群(37例)的血清作为对照。采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术对初治MM患者与健康人群血清进行高通量检测及鉴定，通过计算质量控制(QC)样本的相对标准偏差值(RSD)对样品制备的重现性进行考察。运用偏最小二乘判别分析方法结合t检验校正的方法筛选MM患者及健康人群的差异性代谢物，使用代谢通路分析工具构建代谢通路。
结果
55例MM患者中，男34例，女21例，中位年龄60岁(42~73岁)。根据M蛋白类型进行分型，IgG型30例，IgA型9例，IgM型1例，未分泌型2例，双克隆型1例，轻链型12例(kappa轻链型3例，lambda轻链型9例)。通过对GC-MS实验数据重现性考察，QC样本检测显示代谢物相对含量的RSD<15%的化合物比例为70.21%，提示实验数据可靠。MM患者区别于健康对照人群的17种差异性代谢物为肉豆蔻酸、羟脯氨酸、半胱氨酸、软脂酸、L-亮氨酸、硬脂酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、甘油、丝氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、柠檬酸、肌醇、苏氨酸、草酸(VIP>1，P<0.05)。MM患者的代谢紊乱主要涉及苯丙氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、磷酸肌醇代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、甘油脂代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢。
结论
与健康对照人群比较，初诊MM患者存在明显的代谢轮廓差异和代谢通路扰动。
【关键词】多发性骨髓瘤; 气相色谱-质谱联用; 代谢标志物; 代谢通路
多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一种肿瘤性浆细胞疾病，其特征是骨髓中恶性浆细胞克隆增殖，增殖产生的异常单克隆免疫球蛋白引起骨骼破坏、贫血、肾功能损害及免疫功能异常。代谢组学是生物学的重要组成部分，通过研究不同条件下代谢表型的变化，在发现疾病生物标志物以及揭示发病机制研究中得到了广泛应用。肿瘤发生是一种多因素作用、多步骤发展的病理过程，其发生过程中必然涉及多种代谢变化。本研究中，我们利用气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)技术分析MM患者血清代谢组学的变化，筛选出MM特异性差异代谢物，并对其涉及的相关代谢通路进行初步分析。
一、临床资料
选取2016年8月至2017年10月苏州大学附属第一医院初次确诊的55例MM患者，以相同时期内健康体检的健康人群为对照人群(n＝37)。本研究通过苏州大学附属第一医院伦理委员会批准(审批号：2015054)，并经患者及家属知情同意且签署知情同意书。
二、实验方法
(一)血清标本的采集
留取MM患者初诊时的静脉血清标本55例，健康人群血清样本37例，每份血清标本约3~4 ml。所有的血清标本统一离心(250×g，10 min)获取上清，置入-80 ℃冰箱冻存。
(二)质量控制(quality control, QC)样本的制备
取100 μl血清，混合后涡旋混匀得到QC样本，保存至-80 ℃保存备用。
(三)GC-MS血清样品的前处理方法
将实验血清于-80 ℃冰箱中取出，常温下解冻溶解，涡旋使其充分混匀。血清中加入乙腈，将血清中的蛋白有效沉淀并离心去除，随后采用肟化-硅烷化两步衍生法对代谢物进行衍生化处理，得到较少种类的同分异构体衍生化产物。具体处理步骤如下：将100 μl血清样本加入1.5 ml EP管中，加入400 μl冰乙腈，涡旋混匀后离心(4 ℃，15701×g，15min)，取上清470 μl上清放入1.5 ml EP管内，加入500 μl超纯水，放入-80 ℃冰箱中，保存时间>6 h，随后取出放入冷冻干燥机中进行冻干，时间>12 h。在冻干物内加入50 μl甲氧胺吡啶溶液，涡旋至冻干物完全溶解后，于70 ℃水浴中肟化1 h，随后加入50 μl的N-甲基-N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺，涡旋后放入70 ℃水浴中，硅烷化1 h。衍生完成后，加入100 μl正庚烷并混匀，于4 ℃、15701×g条件下离心15 min，取上清液进行后续的GC-MS分析。
(四)质谱分析
1．GC-MS的分析条件：
采用GC-MS(7890A-5977MSD, Agilent)分析系统进行分析。进样量：1 μl，分流比为100∶1；毛细管柱：DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气：高纯氦气，采用恒流模式；流速：1.1 ml/min。升温程序设置：初始温度70 ℃(保持3 min)，以5 ℃/min的速度匀速上升至310 ℃(保持10 min)，进样口温度及离子源温度均设置为310 ℃。采用电子电离(电压：70 eV)的离子化方式，设置周期为0.3 s。全扫描质量范围为50~500 m/z，溶剂切割时间为3.5 min。GC-MS拟靶标方法采用选择反应检测扫描方式扫描。
2．GC-MS分析方法学评价：
按照实验血清样品前处理方法，平行制备10份QC样本以考察样本制备的重现性。MM组与健康对照组人群的样品随机交替进样，每10个样品间插入一个由所有实验样品混合后制备的QC样品用于监测本次GC-MS分析检测系统的稳定性。
三、统计学分析
在55例MM患者和37例健康对照人群中，随机选取年龄、性别相匹配的17例MM患者和17例健康对照人群进行代谢物质的初步探索，采用SIMCA-P 14.1软件及在线软件MetaboAnalyst 3.0(https：//www.metaboanalyst.ca/)进行统计学分析。运用偏最小二乘-判别分析(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)及t检验结合FDR校正的方法用于筛选MM患者血清特异性差异代谢物，MetaboAnalyst 3.0用于MM特异性差异性代谢物的通路分析。检验水准α＝0.05。
一、临床特征
55例MM患者中，男34例，女21例，年龄42~73岁，中位年龄60岁。37例健康对照组中，男24例，女13例，年龄8~60岁，中位年龄49岁。根据M蛋白类型进行分类，IgG型30例，IgA型9例，IgM型1例，IgD型及IgE型均为0例，未分泌型2例，双克隆型l例，轻链型12例，其中包括kappa轻链型3例，lambda轻链型9例。根据DS分期系统分类，Ⅰ期患者2例，Ⅱ期5例患者，Ⅲ期46例，资料缺失无法判断者2例。根据国际ISS分期系统分类，Ⅰ期患者16例，Ⅱ期19例，Ⅲ期20例。根据国际R-ISS分期系统，Ⅰ期患者16例，Ⅱ期30例，Ⅲ期9例。
二、GC-MS方法稳定性的考察结果和血清代谢物的鉴定
QC样本进行全扫描处理结果见图1。GC-MS技术采集到的QC样本在最终峰表中的代谢特征中，样品总峰面积的70.21%均满足相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)<15%(图2)，说明该GC-MS分析系统的重复性及稳定性较好，可以满足血清样本代谢组学研究的要求。
三、MM血清标志性代谢物的筛选
1．MM患者与健康对照组代谢轮廓比较：
PLS-DA结果显示，MM患者组与健康对照人群代谢轮廓有明显差异(图3)。基于200次循环计算的置换检验显示该模型没有过拟合，表明该模型是有效的(图4)。在PLS-DA模型中，根据代谢物的变量投影重要性数值(variable important in projection, VIP)筛选代谢物，VIP值越大，差异代谢物越有意义，我们以VIP>1作为标准，筛选出19个重要代谢物(图5)。
2．筛选区别于健康对照人群的MM血清代谢标志物：
在多变量PLS-DA模型的基础上，我们利用t检验结合FDR校正分析(P<0.05，FDR<0.05)进一步筛选MM特异性血浆代谢标志物，结果显示，MM患者区别于健康对照人群的17种差异性代谢物为肉豆蔻酸、羟脯氨酸、半胱氨酸、软脂酸、L-亮氨酸、硬脂酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、甘油、丝氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、柠檬酸、肌醇、苏氨酸、草酸(P<0.05, VIP>1.0；表1)。
3．MM代谢通路分析：
将差异性代谢物代入MetPA数据库进行代谢通路分析，结果见表2。MM患者的代谢紊乱主要涉及苯丙氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸的代谢、磷酸肌醇代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、甘油脂代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢(impact>0.1，图6)。
代谢模型能够为丰富信息的组学数据集分析提供框架，随着代谢组学的发展和应用，代谢组学越来越多用于研究人类疾病的代谢变化情况。代谢组学对实验数据分析全面，用以揭示动态代谢变化及补充基因组学和蛋白质组学研究在基础方面的缺失。通过GC-MS技术可以提取所有血清代谢物以产生标志性代谢指纹。本研究首次将GC-MS技术应用于MM患者血清样本表征分析，进一步扩大针对疾病诊断、治疗及预后靶向框架。本研究通过对MM患者及健康对照人群的血清样本进行代谢轮廓比较，结果显示，MM患者与健康对照人群的代谢轮廓存在明显差异，并在MM患者中验证出17种有统计学差异的代谢物。
本研究显示，氨基酸代谢异常与MM密切相关。肿瘤可造成机体氨基酸含量的明显变化，不同的氨基酸对机体的营养和生长作用不同，肿瘤生长有赖于某些氨基酸，而一些氨基酸则会抑制肿瘤细胞生长。有研究显示，人类细胞具有富集并储存氨基酸的能力，并可富集达到环境5~10倍的必需氨基酸，被称为氨基酸池。肿瘤能优先利用某些氨基酸，肿瘤和其他快速生长的细胞具有很小但利用度很高的游离亮氨酸库，快速的利用可造成体内亮氨酸的降低，使得细胞内氨基酸池被耗尽。本研究显示，亮氨酸的减少可能与这种快速利用相关，与之相似，甲硫氨酸可能同样因为肿瘤细胞的利用率升高而被消耗。甲硫氨酸作为一种必需氨基酸，参与多胺合成、DNA甲基化等重要代谢过程。许多恶性肿瘤细胞如前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等均有甲硫氨酸依赖性，即在去除甲硫氨酸后，细胞增殖受到抑制。本实验中我们推测，同亮氨酸相似，甲硫氨酸的减少可能与快速增殖的肿瘤细胞对甲硫氨酸利用度增高有关。本研究实验表明，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径受到干扰。甘氨酸是自然界最简单的氨基酸，参与生长发育、免疫调节、营养代谢等重要过程。甘氨酸一方面可以通过苏氨酸脱氢酶介导的苏氨酸降解产生，一方面由丝氨酸通过丝氨酸羟甲基转移酶合成。甘氨酸及其相关代谢物与肿瘤的发生发展密切相关，Jain等通过检测60个细胞系中219个代谢物水平的变化，结果发现，甘氨酸的消耗与癌细胞增殖速率密切相关，即在快速增殖的癌细胞中，甘氨酸的消耗明显增多，甘氨酸合成酶在快速增殖的癌细胞中表达更高。在MM患者血清内甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸水平的上调可能与癌细胞旺盛的增殖行为有关。半胱氨酸是谷胱甘肽的一个重要组成部分，促进抗氧化活性，能够保护机体组织免受自由基的破坏，半胱氨酸的减少可能导致MM患者的抗氧化功能受损，进而可能导致免疫系统功能受损。羟脯氨酸是一种非必需氨基酸，是机体内胶原组织的主要成分之一，是人体胶原组织代谢和骨吸收的重要指标，羟脯氨酸越低，反映骨有机质的丢失越严重。由骨髓瘤细胞浸润而导致的骨质破坏为MM的重要特征之一，其机制是成骨细胞过度表达白细胞介素6，激活破骨细胞，导致骨质疏松和溶骨性破坏，这可能导致MM中羟脯氨酸含量下降。本实验中MM患者血清中异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸代谢物质变化与相关研究结果使用核磁共振氢谱检测的代谢标志物及其变化一致，其改变可能与骨髓瘤细胞上述氨基酸的低利用率有关。三羧酸循环是产生ATP和提供多种生物合成途径所必需的代谢中心，三羧酸循环中的柠檬酸和苹果酸在MM患者中表现出下调，可能提示三羧酸循环受到抑制。肉豆蔻酸又称十四烷酸，是一种长链饱和脂肪酸，有报道称，13-甲基肉豆蔻酸能特异性地杀伤多种肿瘤细胞并诱导其凋亡。此外，有研究表明，肉豆蔻酸在小鼠模型中有抗宫颈肿瘤的作用。本研究中，肉豆蔻酸含量降低，提示肉豆蔻酸可能在一定程度上抑制肿瘤发生。肌醇与细胞内脂肪酸的氧化有关，肌醇的升高可能会引起能量代谢和脂代谢异常。本研究中肌醇主要参与了肌醇磷酸化。细胞膜的刚性降低通常导致更高的分裂速率，这是恶性细胞的特征之一，细胞膜的刚性降低与硬脂酸去饱和形成油酸有关。Habib等使用亚硝基甲基尿素诱导的大鼠乳腺癌模型，每周1次皮下注射硬脂酸可防止5~10只大鼠的肿瘤发生，提示硬脂酸可能通过维持细胞膜的刚性抑制肿瘤进展，而MM患者体内硬脂酸水平下降可能与肿瘤增殖相关。肿瘤细胞脂代谢异常主要表现为脂肪酸从头合成和脂质合成增强以及脂肪酸分解降低。作为脂质合成的底物，甘油的降低可能提示脂质合成增强。软脂酸又称棕榈酸，是一种饱和脂肪酸，Nagata等用飞行时间二次离子质谱的方法检测出MM细胞中的棕榈酸的平均强度显着低于正常浆细胞中的平均强度；在细胞死亡测定中，棕榈酸剂量依赖性地降低MM细胞和U266细胞活力，棕榈酸给药后24 h凋亡细胞百分比增加，这可能提示软脂酸具有抗MM活力的功能，MM的发病可能与软脂酸水平的降低相关。
通过代谢通路分析，我们发现MM主要涉及苯丙氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、磷酸肌醇代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、甘油脂代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，这些代谢涉及到了氨基酸和饱和脂肪酸的生成和分解，代谢异常可能与MM患者本身肿瘤的生成和增殖有关。
综上所述，肿瘤细胞的恶性进展程度及其动态作用与代谢变化密切相关。我们通过GC-MS技术对初诊MM患者诊断及代谢情况进行了初步探索，MM患者特有的标志性代谢物可能在MM预测和诊断方面具有一定的价值，未来可能作为蛋白组学和基因组学诊断方面的补充。通过对MM相关的代谢通路进行鉴定及时诊断，为进一步研究MM提供了更有价值的线索，为疾病的深入研究奠定了基础。
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