叶酸是人体内主要的甲基基团供体，亚甲基四氢叶酸还原酶( methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是叶酸代谢途径的关键酶之一，其中以位[1]于催化区的677 (C-→T)最为常见J,此种突变基因通过破坏总基因DNA低甲基化、DNA合成与修复障碍而发挥致癌作用[2]近年来，发现Wnt通路在胚胎发育、中枢神经系统形成中起关键作用,而负调控Wnt信号转导的分泌型卷曲相关蛋白1( secreted frizzled related pro-teins 1 , SFRP-1)已经被证明他的下调与人类多种肿瘤相关[3],如乳腺癌[4]、口腔癌[5]等。而笔者首次研究在肾癌发生、发展过程中MTHFR基因多态性对抑癌基因SFRP1的甲基化状态及其mRNA表达的影响。
医学硕士，讲师，副主任医师
毕业于南京医科大学，从事泌尿外科临床、教学及科研10余年,发表论文二十余篇，其中SCI收录十余篇
江苏省医师协会结石分会委员兼秘书
擅长肾结石及输尿管结石、肾脏肿瘤的保肾治疗，熟练掌握输尿管软镜下钬激光碎石术、经皮肾镜碎石取石术、输尿管硬镜下碎石取石术、经皮肾镜联合输尿管软镜碎石术、腹腔镜下输尿管切开取石等先进技术及开放手术技术
1.材料与方法
1.1 材料
收集2010年3月至2010年9月南京医科大学第一附属医院泌尿外科手术切除且每例均经病理证实为透明细胞癌的新鲜肾癌组织及正常肾脏组织各38例,标本分为3部分,切除后立即置液氮冻存，所有病例术前均未接受过放化疗,每例均有详细的临床资料和手术记录,所有标本均经本院高年资病理科医生证实，全部病理诊断基于HE染色和根据WHO组织学诊断标准。病例资料：男25例,女13例;年龄31~91(61.7土14.7)岁,其中≥60岁22例,< 60岁16例;肿瘤径≥5 cm20例,< 5 cm 18例;淋巴结转移20例，无转移18例。Robson 临床分期: I期5例,I期21例,亚期12例。
1.2方法
1.2.1 SFRP 1基因的表达情况 按总RNA提取试剂盒(Trizol,GibcoBRL)的操作说明分别提取不.同来源组织RNA。在提取的总RNA中取10μg按逆转录试剂盒说明以50μL体系逆转录成eDNA,Real-time PCR采用定量PCR中的相对定量法,以β- actin作为内参照,同时以外周正常组织为基准，癌区组织RN的SFRP 1基因(x)表达量均表达成外周正常组织的N倍即(Nx)。用于PCR扩增的特异性引物序列为54AACTTCTTGGGGACAATCTTC-3'和5 -AAGAAGATTGTCCCCAAGAAG-3 ;内参照β-actin引物序列为5 :GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3”和5 -CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。每次定量反应后产物都经30g/L琼脂糖电泳证明为所需扩增的片段。通常情况下，正常组织此值将位于0.3~3.0之间，Nx≥3.0为表达升高,而≤0.3为表达降低。反应条件94C 5 min ,92C 15 s, 60C 1min,40个循环，每次反应均作3复孔,CT取其均值。Nx = 2-△△Ct:△△Ct =△Ct样品-△Ct基准(Ct样品x-Ct样品β-actin)-(Ct基准x-Ct基准β-actin
1.2.2 SFRP-1 基因甲基化分析 按照DNA提取试剂盒(Promega公司)说明提取分别提取不同来源组织DNA。符合后续试验要求后样本DNA中取5~12 μL,按EZ DNA Methylation Gold Kit甲基化修饰试剂盒(美国ZYMO公司)说明书进行甲基化修饰,修饰完成并纯化的DNA经10μL的M-ElutionBuffer洗脱后立即进行分析。MSP基本原理:DNA经亚硫酸氢盐处理后,未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,保留了不发生这种转化的甲基化的胞嘧啶,然后使用分别对甲基化和未甲基化特异的引物进行扩增，探测由此产生差异。甲基化特异性PCR( MSP)引物序列及PCR扩增条件参考文献6], PCR产物采用20 g/L琼脂糖电泳,生物电泳图像系统分析结果。
1.2.3 MTHFR基因型检测 将MTHFR PCR扩增产物理想的样品进行酶切分析。限制性核酸内切酶HinfI特异识别GAGTC酶切位点,当677位点C→T颠换后，会产生一个HinfI酶切位点取PCR扩增产物PCR反应体系为25 μL,10 x Buffer2.5 μL,引物终浓度0.2 μmol/L,Taq DNA聚合酶1 U,模板2μL(约20 ng DNA)及高压双蒸水.扩增条件为:959C预变性5 min ,然后进行35个循环(每个循环包括:94C1min,60.59C1min,72C1min)，最后72C延伸8min.选用PCR扩增产物测序确定是MTHFR677位基因阳性的肾癌标本作为阳性对照，以高压双蒸水代替DNA模板作为空白对照。PCR产物由上海基康生物技术公司纯化并测序.每个酶.切体系的体积为20 μL,上述反应体系置于37C水浴5 ~8 h酶切消化，取酶切产物5 μL,20 g/L琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像图像分析仪观察结果。
1.3统计学处理
采用SAS6.12统计软件包进行统计处理。通过方差分析进行均数间两两比较,两样本率比较用确切概率计算法,P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 SFRP-1 在肾癌组织中的mRNA表达
肾癌组，24例SFRP-1基因mRNA失表达(63% ),9例低于正常对照组(23%) ;正常对照组0.例SFRP-1基因mRNA失表达(0%),2例低于正常对照组(6% )。与外周正常组织相比，肾癌区组织中SFRP 1表达差异显著(P<0.05,图1,2)。
2.2 SFRP-1 启动子甲基化状态分析
在肾癌组,SFRP-1基因在30例中甲基化呈阳性;在正常对照组有2例甲基化阳性,肾癌组织中SFRP-1启动子CpG岛总甲基化率78%显著高于正常组织6%，差异有统计学意义(P<0.001,图3)。
图１ 肾癌组织和正常对照组织ＳＦＲＰ１基因的表达情况
图2 实时定量PCR法检测肾癌组织和正常对照组织中SFPR-1基因mRNA表达
图3 SFRP-1基因启动子CpG岛甲基化检测
2.3肾癌中SFRP-1甲基化状态与其mRNA表达的关系
24例SFRP-1表达缺失的肾癌组织中20例发生甲基化，发生率为84% ( 20/24),3例在表达SFRP-1的癌组织发生甲基化,发生率为33% (3/9)。SFRP-1 mRNA表达阴性与阳性组相比，SFRP-1甲基化有显著性差异(P <0.05)。采用Spearman等级相关分析显示基因甲基化与mRNA表达之间相关系数为r= -0.520,P =0.005,两者呈显著负相关,表明SFRP 1表达水平越低,其基因甲基化率越高。
2.4 MTHFR 基因多态性与SFRP-1 基因mRNA表达及甲基化的关系
SFRP-1表达降低而其启动子甲基化的肾癌区组织中CC基因型患者14例,CT基因型患者3例，TT基因型患者3例,CC基因型mRNA表达明显低于CT基因型(Nx:0.31 +0.32与0.88 +0.97,P <0.05),CT与TT基因型相比有降低趋势(Nx:0.88+0.97与0.94+1.12,图4),但这两种基因型相比无显著差异。提示SFRP-1表达降低可能是由于CC基因型肾癌患者中SFRP-1启动子甲基化更易紊乱所致。
图4 MTHFRC677T基因HinfI限制性内切酶片段长度多态性分布(2.5%琼脂凝胶电泳)注:M 为100 bp ladder,标本1 ~3为CC型,标本4~6为CT型,标本7、8为TT型
3.讨论
肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,其发生、发展涉及到众多信号通路的协同作用,近年来，在许多的人类癌症中发现Wnt/p-catenin信号传导通路在癌变的过程中发挥重要作用,任何在此路径上的组成分子都有可能发生突变而影响该通路正常的信号传导。定位于人染色体8p 11.2上的SFRP-1基因，为拮抗Wnt信号转导的SFRPs(SFRP-1-SFRP5)家族成员之一,是近来发现的新的抑癌基因[6],其抑癌机制可能SFRP-1与受体竞争结合Wnt蛋白或直接与Wnt蛋白结合，由此阻断了Wnt 信号转导通路”,笔者研究发现,肾癌区组织与外周正常组织相比SFRP-1 mRNA表达有降低趋势。近来许多研究发现在肝细胞癌是因为SFRP-的启动子区被异常甲基化而导致SFRP1的失活,因此促进了Wnt/β-catenin传导路径的活化,同时也造成核内转录因子β-catenin的异常堆积。
笔者通过MSP方法检测发现SFRP-1 mRNA失表达的癌区组织有20/24 (84% )存在DNA启动子区高甲基化,而在表达升高或无变化的样品中仅有3/9 (33% )存在高甲基化，提示肾癌组织中SFRP-1mRNA的表达降低与DNA甲基化有关,该基因启动子区的甲基化紊乱可能是SFRP-1基因沉默的主要机制[8]。众所周知，在甲基化过程中,叶酸是主要的甲基基团供体，它在调节包括细胞内甲基化反应和保持基因组稳定性方面不可或缺,其缺乏或代谢障碍与许多肿瘤的发病风险增高相关9。而亚甲基四氢叶酸还原酶( MTHFR)不可逆催化5, 10-亚甲基四氢叶酸转变为5-甲基四氢叶酸,它通过合成SAM而参与多种甲基化过程，其多态性以位于催化区的C677T( dbSNP :rs1801133)最为常见，它可使变异体酶对热不稳定且活性显著降低,影响酶的活性,TT纯合基因型的酶活性仅为CC野生型的30%[10]而酶活性的降低减少改变了SAM水平，从而导致DNA低甲基化，增加了染色体的不稳定性。
目前已有研究发现叶酸摄人和MTHFR基因多态性与部分肿瘤相关基因甲基化紊乱有关,但迄今为止缺乏针对肾癌的研究。为此,笔者还研究了MTHFR基因多态性与SFRP 1基因甲基化及其表达的关系,结果显示肾癌区组织中携带677CC的患者SFRP-1甲基化升高而表达降低，而SFRP-1的甲基化及其表达与MTHFR其他2个常见多态则无显著关系,可能机制为MTHFR 677 CC基因型个体中MTHFR的酶活性与其他两种基因型相比较高,加速了同型半胱氨酸向甲硫氨酸的转变，使SAM水平异常增高,导致了抑癌基因SFRP-1 启动子区的高甲基化,影响SFRP-1的常态表达,削弱了对Wnt/β -catenin传导路径的抑制作用，最终致肿瘤的发生,这一结果也提示组成Wnt/β-catenin传导路径某些原癌基因低甲基化可能也存在MTHFRC677T基因多态性的个体差异。
综上所述，肾癌的发生及发展是一个多阶段的复杂病变过程,位点特异的DNA甲基化调控基因的表达极其重要1。而叶酸代谢酶MTHFR多态性可影响DNA的甲基化和核酸的稳定性，从而间接参与肿瘤的形成12],从本研究亦能看出，MTHFR多态性在肾透明细胞癌中发挥着重要作用,但由于样本数量有限,我们未能进一步探究其他肾癌相关基因与MTHFR多态性的关系,但从这次实验中可看出一定趋势,即MTHFR多态性通过影响部分肾癌相关基因的甲基化状态而调控其表达。因此，大样本的实验有待开展,进一步验证我们的研究结果，同时探讨各基因与肾癌组织分型及Robson 分期的关系，以深人了解肾癌发生发展的分子机制,从而为肾癌的临床辅助诊断、病程监控和治疗提供新的理论依据。
(本文编辑:彭文忠)
(收稿日期:2017-03-16)
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