肝胆癌，包括肝细胞癌（HCC）、肝内胆管癌（ICC）和肝外胆管癌（ECC），是全球高致死性癌症[1]。
临床上，大部分HCC患者在诊断时已处于疾病晚期，这表明在肝癌可治愈的早期阶段精确诊断肝癌刻不容缓[2]。
目前，非侵入性磁共振成像（MRI）已被用来确定肝细胞癌的分期，其中造影剂（CA）用于选择性调节磁共振（MR）信号以提高肿瘤可见性[3]。
钆塞酸二钠（Gd-EOB-DTPA）是临床上HCC首选的肝细胞特异性对比剂[4]。然而，其对小肿瘤的敏感性不高，并且会伴随一系列安全问题[5]。因此，开发临床上适用的新型CA，以安全有效地诊断早期肝肿瘤迫在眉睫。
纳米粒能够克服小分子CA特异性差和信噪比不高的不足，使得其在CA的开发中备受瞩目[6]。然而，肝Kupffer细胞对纳米粒的非特异性吞噬，也导致肝细胞特异性纳米CA的设计颇具挑战[7]。
近日，由西北大学樊海明领衔的研究团队，在国际著名期刊Nature Biomedical Engineering上发表了他们设计合成的一种新型纳米CA[8]。
具体而言，他们制备了一种表面用聚乙二醇-乙氧基-苄基配体修饰的超小锰铁氧体纳米粒（MnFe2O4-EOB-PEG）。该纳米粒依赖Mn2+和EOB配体，可同时实现对肝细胞SLC39A14和OATP1双靶点的协同靶向，实现了对肝细胞的高特异性靶向。此外，MnFe2O4-EOB-PEG用于大型动物肝胆成像的效果，均优于临床肝细胞特异性对比剂（Gd-EOB-DTPA），这表明该纳米粒适用于超敏感和高分辨率的肝胆MRI。
接下来，大家跟着奇点糕一起来看看这项工作是怎么开展的。
首先，樊海明团队在课题组前期研究的基础上，采用动态同步热分解法合成了粒径约为3nm的超小锰铁氧体内核。随后，他们利用配体交换反应使锰铁氧体内核获得多巴胺-PEG-EOB的PEG-EOB外壳，成功制备出粒径为11.7nm的MnFe2O4-EOB-PEG纳米粒。
粒径均匀的MnFe2O4-EOB-PEG纳米粒
此外，他们还利用类似的方法制备得到了对照纳米粒γ-Fe2O3-EOB-PEG和MnFe2O4-mPEG，用于探究内核MnFe2O4和配体EOB-PEG在MnFe2O4-EOB-PEG的肝细胞特异性靶向中的作用。
樊海明团队在体外利用MRI测量纳米粒的弛豫率（用于描述核自旋系统受到射频作用后，从不平衡状态向平衡状态恢复的快慢），发现MnFe2O4-EOB-PEG的纵向弛豫率分别是γ-Fe2O3-EOB-PEG和MnFe2O4-mPEG的1.9和1.86倍。而且，在室温下储存30天后，MnFe2O4-EOB-PEG的纵向弛豫率并无明显改变，表明其具有良好的稳定性。
此外，100μg/mL的MnFe2O4-EOB-PEG在人LO2肝细胞上无明显细胞毒性。经细胞吞噬后，该纳米粒并不引起显著的活性氧产生，再次证明其细胞毒性可忽略。
接下来，樊海明团队利用免疫印迹实验，细胞摄取实验以及超分辨率结构化显微镜图像共定位，对MnFe2O4-EOB-PEG与肝细胞相互作用的主要靶点进行了鉴定。结果显示，γ-Fe2O3-EOB-PEG和MnFe2O4-mPEG分别结合SLC39A14和OATP1，而MnFe2O4-EOB-PEG则可以同时结合SLC39A14和OATP1。
LO2对MnFe2O4-mPEG具有更高的摄取率
考虑到MR信号强弱通常与CA摄取量呈正相关，樊海明团队在体外对比了LO2对前述三种纳米粒在不同时间点的摄取情况。结果显示，LO2D在不同时间点对MnFe2O4-EOB-PEG均具有更高的摄取能力。
通过对比前述三种纳米粒与经裂解的靶细胞蛋白的结合能力来评估纳米粒与肝细胞的亲和力，他们再次确认了MnFe2O4-EOB-PEG对肝细胞的亲和能力分别是γ-Fe2O3-EOB-PEG和MnFe2O4-mPEG的5.35和2.77倍。
γ-Fe2O3-EOB-PEG，MnFe2O4-mPEG和MnFe2O4-EOB-PEG在猪体内的MRI
为了测试MnFe2O4-EOB-PEG是否适用于体内MRI，樊海明团队在猪的体内给予等剂量的γ-Fe2O3-EOB-PEG，MnFe2O4-mPEG和MnFe2O4-EOB-PEG，同时进行60分钟的动态T1加权的MRI采集。其中，MnFe2O4-EOB-PEG组肝脏的T1加权MR图像高度增亮，可以明显识别出胆管等结构细节，而其余两组的MR信号增强则较低。
随后，樊海明团队利用二氨基联苯胺（DAB）染色检测前述三种纳米粒在肝脏的分布。他们发现，MnFe2O4-EOB-PEG主要分布在肝细胞中（70.59%），而γ-Fe2O3-EOB-PEG和MnFe2O4-mPEG则在肝细胞（21.79%和28.46%）和Kupffer细胞中均被观察到。这表明MnFe2O4-EOB-PEG在体内具有高特异性的肝细胞靶向能力。
此外，药代动力学和生物分布实验再次证实了MnFe2O4-EOB-PEG高特异性肝细胞靶向，以及肝细胞对其的快速摄取和快速胆道清除，仅有不足1%的MnFe2O4-EOB-PEG会在注射7天后留存在组织中。
纳米CA的生物安全性是其临床应用面临的关键问题。因此，樊海明团队对接受MnFe2O4-EOB-PEG注射的猪进行血生化，血常规以及脑部和主要脏器的组织学检查。结果均显示静脉注射15μmol（Fe+Mn）kg−1的MnFe2O4-EOB-PEG，对猪不会造成明显的毒副作用。这表明MnFe2O4-EOB-PEG具有良好的生物安全性，并具有临床转化的潜力。
为了验证MnFe2O4-EOB-PEG相比于临床肝细胞特异性对比剂（Gd-EOB-DTPA）在早期诊断上是否具有优势，樊海明团队建立了兔VX2肝癌移植模型。通过设立OATP1B1和/或SLC39A14受体阻断组，他们在肝癌植入后第7天，对不同组别的兔子注射15μmol（Fe+Mn）kg−1的MnFe2O4-EOB-PEG进行MRI检查。48h后，兔子再次接受25μmol（Gd）kg−1Gd-EOB-DTPA的MRI检查。结果表明，MnFe2O4-EOB-PEG与Gd-EOB-DTPA相比具有更显著的肝细胞特异性，更利于HCC的早期高效诊断。
MnFe2O4-EOB-PEG（左）较Gd-EOB-DTPA（中）检测超小肝肿瘤的效果对比
而通过对比两种CA在超小肝肿瘤（小于5mm）的肝胆MRI结果，樊海明团队发现MnFe2O4-EOB-PEG可以清晰识别肿瘤，而Gd-EOB-DTPA则不能。
此外，相比于Gd-EOB-DTPA的非均匀性增强和冗余的血管伪影，MnFe2O4-EOB-PEG在肝脏实质的均匀增强有助于避免误诊的发生。总的来说，MnFe2O4-EOB-PEG对超小肝肿瘤的检出率高达92%（23/25），远超Gd-EOB-DTPA（48%，12/25）。
Gd-EOB-DTPA和MnFe2O4-EOB-PEG增强的MRI对比
最后，樊海明团队对比了MnFe2O4-EOB-PEG和Gd-EOB-DTPA对猕猴肝胆道影像学检查的结果。他们发现，MnFe2O4-EOB-PEG组可以清楚地显示直径约为0.5毫米的肝导管，而后者显示的肝导管则模糊不清。此外，MnFe2O4-EOB-PEG还实现了更快（延迟时间减少20分钟）的胆道成像。
在猕猴胆道梗阻模型中，Gd-EOB-DTPA增强的MR显示胆总管增强较弱，且无法看到梗阻部位。而MnFe2O4-EOB-PEG增强的MR胆管造影图像中不仅观察到增强的肝外胆管树，梗阻部位也可以清晰地显示出来。
总的来说，樊海明团队制备合成了超小的聚乙二醇-乙氧基-苄基修饰的锰铁氧体纳米粒（MnFe2O4-EOB-PEG），并在体外和体内实验中验证了该纳米粒具有高特异性肝细胞靶向能力和良好的生物安全性。
此外，他们首次报道了肝细胞特异性纳米颗粒在大型动物肝胆MRI中的应用，并将其与临床肝细胞特异性对比剂（Gd-EOB-DTPA）比较，从而验证了MnFe2O4-EOB-PEG是一种更敏感，更安全的CA，具有高肝细胞特异性，可以实现高分辨率肝胆MRI，并显著提高早期肝肿瘤的检测灵敏度。
MnFe2O4-EOB-PEG在超小的肝肿瘤和其他病变的非侵入性MRI诊断中比临床使用的Gd-EOB-DTPA具有相当大的优势并具有良好的生物相容性，具有成为下一代临床肝脏特异性MRI CA的潜力。
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