由于肿瘤免疫微环境的复杂性，单一生物标志物不足以预测胃癌（GC）患者的免疫治疗反应。肿瘤浸润免疫细胞（TIICs）的密度和空间分布可能具有重要预测价值。
近日，Nature Communications期刊（IF=17.694）发表北京大学肿瘤医院沈琳教授团队研究，证实多维TIIC特征可能可预测GC患者的PD-1/PD-L1抑制剂获益。
研究背景
免疫检查点抑制剂（ICI）可为GC带来强力而持续的反应。然而ICI治疗晚期GC的反应率为10%~26%，还缺乏选择生物标志物。很多生物标志物如肿瘤突变负荷（TMB），PD-L1表达，微卫星不稳定（MSI）和EB病毒（EBV）感染状态可能和ICI敏感性相关。但是使用这些生物标志物的临床研究结果并不一致。不同亚类的免疫细胞分布和精准定位可能是肿瘤行为的有价值预测因素。因此，分析细胞和非细胞成分的空间相关性将有助于理解GC生物学和发现有效的肿瘤免疫生物标志物。
研究方法
纳入80例确诊胃腺癌患者的治疗前标本。行CD8，PD-1，TIM-3，LAG-3，CD4，FoxP3，CTLA-4，PD-L1，CD68，CD163，HLA-DR，STING，CD20和CD66b等多重免疫组化（m-IHC）分析，使用多谱成像分析，分析影像学数据，并构建机器学习模型。
研究结果
GC患者的临床病理学特征
研究纳入2014年7月~2019年12月期间的80例患者。60例接受免疫治疗的患者中，21例接受标准抗PD-1/PD-L1治疗，39例入组临床试验。所有患者均有治疗前存档标本。10例（12.5%）患者为EBV（+），11例（13.75%）确认DNA错配修复缺失（dMMR）。
TIIC分布的总体情况
为研究GC标本中的TIICs情况，通过m-IHC定量了80例标本的免疫细胞密度和空间位置，分析16种蛋白质的亚细胞表达。检测肿瘤核心（TC），侵犯边缘（IM）和肿瘤周围正常（N）区域HR染色，定义为感兴趣区域（ROIs）。
不同ROIs的TIICs分布不同
富集的免疫细胞群可定义结构性免疫环境。和邻近正常组织相比，TC中CD68+细胞的总密度显著增加；而CD8+和CD20+细胞具有相反趋势（图1a）。CD8+，CD8+PD-1-LAG-3-，CD20+和CD68+CD163+HLA-DR-细胞累积于IM中而在TC中降低。相反，CD8+PD-1+TIM-3+，CD8+PD-1−TIM3+，CD8+PD-1+LAG-3+TIM-3+，CD8+PD-1+LAG-3-TIM-3+，CD4+FoxP3+CTLA-4+，CD4+FoxP3−CTLA-4+，CD68+，CD68+HLA-DR+CD163-细胞累积于TC而在IM中降低。和正常组织相比，TC中的CD4+FoxP3+和CD4+FoxP3+PD-L1+细胞具有更高密度（图1b），表明GC中TIIC的异质性分布。
图1 （a）不同区域的TIIC组成；（b）ROI的的TIIC密度
不同分子亚型中TIICs的浸润特征不同
不同Lauren分类、肿瘤分化和肿瘤部位的TIICs没有显著区别。HER2阳性和阴性GC的TIIC密度没有显著差异。总的CD8+，CD4+和CD68+细胞密度和疾病分期相关。晚期GC样本具有更高的耗竭CD8+T细胞和CD4+FoxP3-细胞。
和EBV阴性肿瘤相比，EBV阳性肿瘤具有更高的CD8+PD-1-LAG-3-细胞密度和丰富的免疫细胞浸润。和dMMR肿瘤相比，MMR完整（pMMR）肿瘤具有显著更高的CD4+，CD68+，CD20+和CD66b+细胞。将患者分为4类联合阳性分数（CPS）组：CPS＜1，1≤CPS＜5，5≤CPS＜10和CPS≥10。TIICs丰度随着CPS增加而增加。但是，CPS 5~10和CPS≥10的TIIC无显著差异，提供了免疫治疗的界值选择证据。免疫细胞浸润特征依赖但是不限于GC分子亚型。
根据TIICs浸润密度的生存分析
研究发现更高水平的肿瘤浸润T细胞亚群，包括CD8+PD-1+LAG-3+TIM-3+，CD4+FoxP3+CTLA-4+ T和CD68+STING+细胞和更差的总生存（OS）相关（图2）。CD8+PD-1+LAG-3+TIM-3+细胞（高 vs 低，HR 1.98）和CD68+STING+细胞（高 vs 低，HR 1.83）与OS显著相关，表明肿瘤浸润T细胞在患者生存中的临床意义。
图2 TIIC密度和OS的相关性
分析TIICs密度的预后价值，发现瘤巢中更高的CD8+PD-1+LAG-3+TIM-3+ T和CD68+巨噬细胞浸润和更差的OS相关。基质更高的CD8+PD-1+TIM-3+ T细胞，CD66b+中性粒细胞和CD68+STING+巨噬细胞和更短的OS相关。
GC空间分析显示肿瘤和免疫细胞的分级组织
为进一步研究位置特征，使用确定核-核距离的生物信息学工具。整合两种细胞的距离和数量建立“有效分数”参数，也即肿瘤细胞旁的TIIC比例。更高的有效分数表明在某个距离内，免疫细胞周围具有更高的肿瘤细胞密度。在3个距离内（0~10/0~20/0~30 μm），CD8+PD-1+LAG-3+T细胞和CD66b+中性粒细胞具有更高的有效分数（图3）。
图3 不同距离TIIC的有效分数
中性粒细胞，B细胞和巨噬细胞和肿瘤细胞距离更近。根据PD-L1 CPS分析TIICs和肿瘤细胞的距离，显示CPS≥10的患者中TIICs和肿瘤细胞距离更近。
有效分数在不同GC分子亚型中也不同。例如HER2阴性GC中， 20 μm半径内耗竭T细胞（CD8+PD-1+LAG-3+TIM-3-，CD8+PD-1−TIM-3+），M1（CD68+CD163+HLA-DR-）和M2（CD68+HLA-DR+CD163-）的有效分数显著更高。
癌症细胞相邻TIICs和患者生存相关
研究发现和更低有效密度患者相比，具有更高有效密度（0~20 μm）的CD68+STING+巨噬细胞，CD68+HLA-DR+CD163-STING+巨噬细胞和中性粒细胞具有显著更短的OS（图4）。其他免疫细胞表型和OS不相关。结果表明TIIC对患者生存的影响不仅依赖于TIICs数量，而且依赖于其与肿瘤细胞的距离，TIICs的位置和密度均是预测预后的考虑因素。
图4 基于TIICs有效密度的OS
多维TIIC特征预测免疫治疗反应
探索TIICs密度和有效分数和免疫治疗结局的相关性。60例接受免疫治疗的患者分配至训练（n=44）和验证（n=16）队列。研究发现CD4+FoxP3−PD-L1+ T细胞密度和CD8+PD-1+LAG-3- T细胞有效分数和免疫治疗正性反应密切相关。
而CD8+PD-1-LAG-3- T细胞和CD68+STING+巨噬细胞和免疫治疗负性反应密切相关。使用CD4+FoxP3-PD-L1+ T细胞，CD8+PD-1-LAG3- T细胞和CD68+STING+巨噬细胞，和CD8+PD-1+LAG3- T细胞有效分数用来定义TIIC特征，以改善发现免疫治疗反应患者的能力，显示TIIC特征具有良好预测价值。TIIC分数联合CPS，EBV状态和MMR状态的预测力度具有更好的曲线下面积（AUC）。
对每个标志物在预测模型中的作用进行定量，显示CD8+PD-1+LAG-3-细胞的有效分数具有最高重要性。因此，免疫治疗反应的主要预测标志物是空间组织。同时研究还发现PD-L1 CPS的训练和验证队列的AUCs分别是0.58和0.76。EBV阳性状态和dMMR似乎和更好反应具有相关趋势。单变量和多变量分析中HER2表达和治疗反应相关性不一致。因此，TIIC特征对于患者分层具有更高效力。
TIIC特征在免疫治疗中的预后应用
分析中根据TIIC特征将患者分为高分和低分组，发现验证组的免疫相关无进展生存期（irPFS）和免疫相关OS（irOS）具有显著差异。因此TIIC特征可能有助于发现哪些患者具有活跃抗肿瘤免疫反应。
讨论
目前GC的临床实践推荐主要是基于疾病分期和HER2，PD-L1 CPS，EBV和MSI状态。但是还需要更准确的预后参数指导个体化治疗。例如联合帕博利珠单抗和曲妥珠单抗及化疗在HER2阳性晚期GC患者中具有良好疗效，而抗HER2和抗PD-1/PD-L1之间的协同作用机制还不清楚。该研究结果显示HER2阴性患者中耗竭T细胞和M1、M2巨噬细胞的有效分数高于HER2阳性患者，提示免疫治疗的不良肿瘤微环境。
既往研究对于CD8+T细胞预后作用的结论矛盾。研究中CD8+T细胞可分为不同亚类。CD8+PD-1+LAG-3+TIM-3+ T细胞和CD68+STING+巨噬细胞更高密度和更差的OS相关。CD8+T细胞不同的PD-1表达表明T细胞耗竭。
研究还发现最高有效密度的CD68+STING+巨噬细胞，CD68+HLA-DR+CD163−STING+巨噬细胞和中性粒细胞具有显著缩短的OS。CD68+STING+巨噬细胞密度和有效密度都和更差的OS相关。结果验证了STING的不良预后作用。联合空间标志物可增强预后价值。
CD4+FoxP3−PD-L1+ T细胞密度和CD8+PD-1+LAG3- T细胞有效分数和免疫治疗正性反应相关。更高的有效分数表明更高数量的配对免疫细胞和肿瘤细胞。CD8+PD-1−LAG3- T细胞和CD68+STING+巨噬细胞和免疫治疗负性反应相关。因此，TIIC特征可预测免疫治疗反应。
综上，研究结果表明肿瘤免疫浸润的多维标志物评估可作为GC强力定量预测工具。对于GC标本微环境组分的探索有助于为复杂和异质性免疫环境相关肿瘤进展和免疫治疗反应带来更为深入的理解。
Chen Y, et al. Predicting response to immunotherapy in gastric cancer via multi-dimensional analyses of the tumour immune microenvironment. Nat Commun. 2022;13(1):4851.
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