胰腺导管腺癌（PDAC）目前仍是人类最致命的恶性肿瘤之一，5年总生存率仅9%1。尽管目前立体定向放射治疗（SBRT）已被用于PDAC治疗，但放疗在胰腺癌治疗中的角色一直以来都有争议。与此同时，虽然STAT3是PDAC疾病进展、转移和治疗耐药的已知关键因素，但其对PDAC肿瘤微环境（TME）内免疫亚群的影响仍尚不明确。
近日，一项发表于国际顶级杂志Clinical Cancer Research的基础研究发现，全身给予STAT3反义寡核苷酸（ASO）联合SBRT可致肿瘤生长消退、转移减少和免疫抑制逆转。该研究表明，STAT3 ASO+放疗（RT）等联合治疗可改善胰腺癌的治疗反应，参与控制转移负荷的细胞群在本文中得以详细的表述。【肿瘤资讯】特此整理报道！
研究背景
目前，胰腺导管腺癌（PDAC）仍然是世界上最致命的恶性肿瘤之一，侵袭性和转移性是其治疗的主要难题。相关证据表明，PDAC转移是一个复杂的过程，涉及多个细胞群和各种信号通路，因此难以进行有效靶向。不仅如此，PDAC还表现出不同的分子行为，这使其对常规治疗和靶向治疗耐药。这种治疗失败归因于多种固有和适应性生物学起源，最显著的可能原因之一是免疫抑制性TME导致的耐药性。
PDAC的肿瘤微环境（TME）通常被描述为免疫“沙漠“，一是缺乏细胞毒性效应免疫细胞，如自然杀伤（NK）、CD4+和CD8+ T细胞；二是TME被高度免疫抑制细胞渗透，如调节性T细胞（Tregs）。各种免疫调节因素，包括放疗（RT），已被用于激发PDAC的免疫应答。然而，以上治疗方式的疗效有限。本研究认为Tregs、NK细胞和树突状细胞（DC）是介导RT反应的关键免疫细胞，信号转导和转录激活子3（STAT3）是NK和Treg免疫细胞亚群内的过度表达信号。目前已知STAT3是PDAC耐药的驱动因素，而STAT3信号对免疫亚群影响其细胞毒性、抑制性或监测潜力的机制，以及该信号如何在RT背景下调节局部生长和全身播散仍有待探索。为此，本研究对入PDAC组患者的组织样本进行分析，并通过动物模型研究作进一步探究。
研究方法
本研究入组2018年1月~2018年12月间的临界可切除胰腺癌患者，这些患者接受FOLFIRINOX或基于吉西他滨的新辅助化疗联合SBRT，后行手术切除。本研究对患者PDAC组织样本进行RNA测序分析，以确定RT后免疫浸润的变化；并使用基因工程小鼠品系结合PDAC原位肿瘤模型表征疾病进展。使用流式细胞术分析肿瘤浸润、循环和淋巴结免疫群。
研究结果
RT增加了DC浸润和活化，但也增加了Tregs浸润
对接受SBRT治疗前后的人PDAC肿瘤进行了配对RNA测序和细胞类型组成分析，结果显示整体免疫浸润减少，特异性免疫亚群有明显变化。尽管SBRT增加了DC的浸润与活化（图1B），但也增加了Tregs的浸润（图1 C），SBRT后CD8+ T细胞浸润无变化（图1D）。
图1A-E. SBRT增加肿瘤内DC活化和Treg频率
本研究确定能有效预测对SBRT反应的免疫细胞为NK细胞、CD8+效应记忆T细胞和初始CD8+T细胞，通过该分析发现，在基线时对SBRT有反应的患者肿瘤中显著存在更多的NK细胞（图1F）。此外，在接受治疗前，应答者的TME中初始CD8 T细胞显著减少，CD8效应记忆T细胞显著增加，揭示NK细胞和CD8+T细胞活化在介导PDAC对RT反应中的重要平衡。
从接受SBRT前、中、后PDAC患者外周血中存在的细胞因子来看，本研究未观察到RT后免疫刺激细胞因子的变化，进一步验证了单独SBRT不足以引起持久的T细胞介导的抗肿瘤免疫应答的观点。研究数据表明，虽然RT能够招募和激活DC，但不足以克服由此产生的免疫抑制，也不能激活NK细胞和CD8+T细胞的细胞毒性群体。
图1F-G. SBRT不能激活效应T/ NK细胞
Tregs和NK细胞的遗传&药理学耗竭分别增强和减弱对RT的反应
研究发现，在小鼠局部原位肿瘤模型中，当用RT治疗时，Tregs的药理学耗竭显著改善了生存率（图2C）。当Tregs作为联合RT的治疗靶点，DEREG模型中Tregs的基因耗竭导致RT反应的总生存期显著改善（图2D）。
临床数据强调了NK细胞在PDAC患者预后中的重要性。本研究发现，在没有NK细胞的情况下，抗体介导的耗竭显著降低对RT的反应（图2E-F），这与人体数据一致。此外，还发现接受NK细胞耗竭和RT治疗的小鼠循环肿瘤细胞（CTC）比仅接受RT的对照组增加，揭示NK细胞在控制转移负荷中的重要作用。
图2. 低水平的Tregs、高水平的NK细胞与PDAC的生存率相关
靶向抑制Tregs表达的STAT3可改善局部和远处疾病进展的控制，并增强NK细胞介导的转移免疫监视
在FoxP3-Cre/fl STAT3小鼠模型中，进行FoxP3表达细胞中的STAT3基因敲除。研究发现，STAT3敲除FoxP3+细胞组与对照组（MS=23.5天）相比，显著改善了小鼠的生存率（MS=32.5天），RT治疗后生存率得到进一步改善（MS=37天）（图3A）。这些数据表明，Treg表达的STAT3在促进局部和远处疾病进展中具有重要作用。
图3. STAT3在Tregs上的遗传靶向作用
研究还发现，在无辐射背景下，NKp46+细胞上基因敲除STAT3（NKp46-Cre/STAT3 fl）没有导致小鼠生存率的变化（图4A）。然而，STAT3敲除NK细胞联合RT组比单独RT组的生存率明显恶化（图4B）。这表明STAT3在NK细胞介导的转移和疾病扩散控制中的重要作用，并提示了Tregs诱导NK细胞抑制的机制。
图4. 靶向Treg抑制可改善NK细胞介导的转移监测
STAT3 ASO+RT联合治疗可增强全身免疫活化，在原位和转移性肿瘤模型中具有生存优势
研究发现，在小鼠局部原位肿瘤模型中，STAT3 ASO治疗联合RT（MS=34天）时，与对照组（MS=29天）相比，小鼠具有生存优势改善（图5A）。然而，当用RT（MS=26天）或STAT3 ASO单独（MS=31天）处理小鼠时，存活率无改善，这表明STAT3 ASO+RT处理具有协同效应（图5A）。
研究再次发现，在小鼠转移性原位肿瘤模型中，只有当用STAT3 ASO和RT处理小鼠时（MS=33天），存活率才会提高（图5B）。STAT3 ASO单独治疗（MS=28天）与对照（MS=28天）或RT单独治疗（MS=26天）相比未改善生存期，表明联合治疗不仅可有效控制局部进展，还可有效控制远处扩散。
图5a-b. STAT3 ASO+RT联合治疗可改善生存期
在确定STAT3 ASO+RT是一种有效的治疗方法后，对于胰腺荷瘤小鼠肿瘤、外周血和淋巴结中的白细胞频率和活化的流式细胞分析结果显示，与STAT3 ASO单独给药相比，STAT3 ASO+RT治疗后肿瘤内Tregs显著降低（图5F），联合给药组肿瘤浸润DC显著增加（图5G）。与单独RT相比，STAT3 ASO+RT联合处理小鼠的血液和淋巴结中CD4+T细胞活化均增加（图5H）。此外，与对照组相比，联合给药组中循环NK和CD8+T细胞活化标志物（包括GnzmB、CD44和IFNα）的表达增加（图5F-J），提示STAT3 ASO+RT治疗可增加循环抗肿瘤免疫群的活性，降低肿瘤内免疫抑制群的频率。
图5F-G. STAT3 ASO+RT联合治疗可增强全身免疫活化
STAT3 ASO + RT治疗的反应依赖于NK和DC亚群
研究发现，通过抗体介导的耗竭，STAT3 ASO+RT联合治疗的益处在NK细胞缺失的情况下被消除（图6G），这表明NK细胞在介导抗肿瘤免疫反应中的关键作用。使用流式细胞分析发现，NK缺失后对STAT3 ASO+ RT治疗的反应减弱，伴随着肿瘤中CD4+T细胞IL-10和FoxP3表达的增加，以及DC表达CD103和淋巴结中CD4+T细胞活化的下降。由此揭示了NK细胞活性对STAT3 ASO+RT治疗反应改善的依赖性。
图6. 细胞相互作用示意图
结论
靶向Treg介导的免疫抑制是介导PDAC治疗反应的关键步骤，NK细胞不仅是提高生存率的预后标志物，而且是对抗转移的效应细胞群。
讨论
由于癌细胞表达的STAT3与多种致癌途径有关，STAT3信号级联通路已成为新型化疗药物的作用靶点。目前，虽然小分子STAT3抑制剂的开发面临挑战，但本研究中的STAT3 ASO在患者中显示出良好的耐受性。
Tregs是胰腺癌治疗抵抗的核心元素，肿瘤内Tregs的存在和频率与PDAC的不良预后相关。只有当Tregs被耗尽或作为功能抑制的靶点时，局部和全身治疗的控制才得以建立。研究还发现靶向Treg功能导致CTCs的存在显著减少和转移负荷减少，为Treg是治疗抵抗的主要调节因子，且应答仅在没有Treg诱导的免疫抑制系统中得到改善提供了额外的证据支持。
NK细胞在控制转移进展中发挥的核心作用。该研究不仅显示STAT3 ASO+RT联合治疗的治疗效果依赖于NK细胞的存在，而且表明在NK细胞缺失的情况下，转移扩散的发生率和严重程度显著增加。由于NK细胞与改善PDAC的总生存期相关，多项证据提示维持活化可能增强NK介导的CTC监视并改善对RT的反应。本研究认为，虽然激动NK细胞的药物可能使治疗有效，但如果单独给药而不同时靶向Treg介导的免疫抑制，其作用是不够的。
鉴于ALLIANCE试验2的最新结果，RT的争议作用不容忽视。本研究发现RT诱导的DC活化对反应至关重要，因为在缺乏这些活化的DC亚群中，STAT3 ASO+RT联合的治疗效果无效。
综上，Treg和NK细胞上STAT3的双重靶向激发DC和T效应细胞反应，改善对SBRT的反应，并导致转移负荷减少，为PDAC患者的随访研究提供了依据。
1、 Piper M, et al. Targeting Treg-Expressed STAT3 Enhances NK-Mediated Surveillance of Metastasis and Improves Therapeutic Response in Pancreatic Adenocarcinoma[J]. Clin Cancer Res. 2022 Mar 1;28(5):1013-1026.
2、 Katz, M. H. G., et al. Alliance A021501: Preoperative mFOLFIRINOX or mFOLFIRINOX plus hypofractionated radiation therapy (RT) for borderline resectable (BR) adenocarcinoma of the pancreas. Journal of Clinical Oncology 2021, 39 (3_suppl), 377-377.
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