BRAF+最前沿月评项目秉承传递最新医学进展的理念，以专业视角多维度关注领域最新进展。本期精选了在间变性甲状腺癌（ATC）中酪氨酸激酶抑制剂疗法多模式治疗结果：一项真实世界经验和中国人群直肠黏膜黑色素瘤的基因变异，以及黑色素瘤患者BRAF等位基因高突变频率与病理特征及靶向治疗反应的相关性等内容，特别邀请河南大学肿瘤医院(郑州市第三人民医院)梁宪斌教授为我们带来深入解读。
郑州市第三人民医院黑色素瘤及肿瘤综合内科副主任
中国临床肿瘤学会(CSCO )黑色素瘤专业委员会委员
中国临床肿瘤学会(CSCO )黑色素瘤专业委员会青委会常务委员
中国抗癌协会（CACA）肉瘤专业委员会黑色素瘤学组委员
北京医学奖励基金会肺癌青年专家委员会委员
河南省呼吸与危重症学会肺癌分会青委会副主任委员
河南省抗癌协会靶向治疗专业委员会青委会常务委员
河南省抗癌协会肿瘤精准诊断与治疗专委会委员
河南省抗癌协会肺癌专业委员会委员
郑州市抗癌协会肿瘤临床化疗专业委员会常务委员
1. 在间变性甲状腺癌中酪氨酸激酶抑制剂疗法多模式治疗结果：一项真实世界经验
2. 中国人群直肠黏膜黑色素瘤的基因变异
3. PTENP1-AS与BRAF抑制剂耐药机制及III期黑色素瘤患者的不良预后相关
4. 黑色素瘤患者BRAF等位基因高突变频率与病理特征及靶向治疗反应的相关性
5. BRAF、MEK和CDK4/6抑制剂的免疫调节作用：靶向联合免疫治疗黑色素瘤的意义
1. 在间变性甲状腺癌中酪氨酸激酶抑制剂疗法多模式治疗结果：一项真实世界经验
研究目的: 甲状腺未分化癌（ATC）预后不佳，目前尚无有效的治疗方法。我们的目的是评估酪氨酸激酶抑制剂（TKI）在真实世界中的疗效，并根据联合疗法提供最有效的治疗组合。
研究方法: 这项回顾性研究评估了韩国三星医疗中心ATC患者采用多模式治疗的临床结果和死亡原因。
研究结果：共有120例ATC患者接受了治疗：77例（64.2%）患者接受了手术，放疗64例（53.3%），化疗29例（24.2%），TKI治疗19例（15.8%）。在TKI治疗组中，8例获得部分缓解（3例使用乐伐替尼，5例使用达拉非尼+曲美替尼），其中2例乐伐替尼治疗患者疾病稳定。TKI治疗组的中位无进展生存期（PFS）为2.7个月（范围: 0.1~12.7），中位总生存期（OS）为12.4个月（范围: 1.7~47.7）。接受手术或局部放疗的患者比未接受手术或放疗的患者获得更好OS。在多变量分析中，手术、TKI治疗、年龄小、无远处转移与更好的OS相关。手术、放疗和TKI联合治疗最有效（中位OS: 34.3个月，6个月生存率77.8%）。与没有TKI治疗的时代相比，远处转移已成为ATC患者死亡的主要原因。
研究结论：包含TKI的多模式治疗可延长ATC生存期，达拉非尼联合曲美替尼是BRAF突变ATC患者最有效的治疗选择。
间变性甲状腺癌（ATC）又称未分化甲状腺癌，是一种罕见但高侵袭性、高致命性肿瘤，占所有甲状腺肿瘤的2%。多数ATC因为肿瘤生长快且侵袭性高，确诊时已出现远处转移或局部外侵压迫气管、食管等，气道梗阻是主要致死原因之一，传统的治疗方法包括外科手术、术后瘤床放射治疗及全身化疗等。既往研究表明，因ATC的独特生物学行为，即使采取包含手术、放疗、化疗在内的综合治疗，整体预后并未得到明显改善，中位OS为4个月。
靶向时代的到来给ATC患者带来新希望，研究表明：MAPK信号转导通路异常高发于ATC，BRAF位点突变频率在40%左右，含酪氨酸激酶抑制剂（乐伐替尼、维莫非尼、达拉非尼+曲美替尼）在内的多模式治疗可明显延长患者的生存时间。2015年，乐伐替尼在日本被批准用于ATC患者的治疗。2018年美国食品药品监督管理局（FDA）批准达拉非尼+曲美替尼用于有BRAF V600突变ATC患者的治疗。
该研究是一项回顾性研究，纳入了三星医学中心1995年~2020年经病理证实为ATC的120例患者，通过分析酪氨酸激酶抑制剂引入前后多模式治疗方案的效果，证实手术+放疗+酪氨酸激酶抑制剂方案能给患者带来更长的生存获益（中位OS 34.3月，6个月生存率77.8%），达拉非尼+曲美替尼治疗BRAF V600突变ATC的ORR率为100%（5/5），含达拉非尼+曲美替尼的多模式治疗方案显示出了更好的治疗效果。
尽管这只是一项回顾性研究，且纳入的BRAF突变患者例数较少（5例），但有鉴于ATC患者中较高的BRAF V600突变率，希望大样本随机对照研究能进一步验证达拉非尼+曲美替尼在ATC患者多模式治疗中的优效性地位，提供更多循证医学证据。
表1. 联合治疗对总生存率的影响
图1. TKI治疗组的缓解率和PFS（*仍在治疗的患者）
2. 中国人群直肠黏膜黑色素瘤的基因变异
研究背景：直肠黏膜黑色素瘤（RMM）是一种罕见的高度侵袭性疾病，预后较差。由于RMM罕见，对其遗传机制的研究很少。本研究旨在分析中国人群RMM的遗传谱和预后，为靶向治疗奠定基础。
研究方法：纳入北京大学肿瘤医院36例原发性RMM患者作为研究对象。肿瘤样本二代测序（NGS）数据被拟合到TruSight™ 肿瘤学500（TSO 500）Docker检测基因组变异。然后，进行单因素和多因素的COX风险分析，评估基因组变异与OS的相关性，并进行Kaplan-Meier和log-rank检验以确定其显著性。
研究结果：在单因素分析中，BRAF突变、NRG1缺失和有丝分裂指数是影响预后的重要因素。在对原发性RMM患者OS相关预后因素的多因素分析中，发现2个重要基因变异：BRAF突变 [HR 7.732（95%CI:1.735~34.456），P=0.007]和NRG1缺失[HR 14.976（95%CI:2.305~97.300），P=0.005]。
研究结论：这是第一个专门针对中国人群RMM患者的基因变异的研究。我们证实RMM的基因变异不同于皮肤黑色素瘤（CM）。我们的研究表明BRAF和NRG1与RMM预后不良相关，可能是RMM治疗的潜在靶点。
黏膜黑色素瘤是中国人群高发（22.6%）而西方高加索人群低发（1.3%）的恶性肿瘤，在流行病学、病理特征、基因组学、整体预后等方面与皮肤黑色素瘤均有明显差异。直肠黏膜黑色素瘤（RMM）是相对高发亚型之一，因绝对发病人数少，目前尚无大样本临床试验揭示基因组学特征与预后的关系。
本文献是第一个针对中国人群直肠黏膜黑色素瘤的回顾性研究，共纳入北京大学肿瘤医院经病理证实为直肠黏膜黑色素瘤的患者36例，通过总结归纳患者的年龄、分期、病理特征等，采用NGS技术检测肿瘤标本热点基因突变及拷贝数变异类型，进行单因素和多因素COX风险分析，评估基因组学变异与OS的相关性，并进行Kaplan-Meier和log-rank确定其显著性。
结果提示，RMM中基因突变图谱与皮肤黑色素瘤有明显差异，KIT突变比例最高，占33.3%，BRAF、TP53和NRAS突变率分别为：13.9%、13.8%和2.8%，MYC (9/36，25%)、PDGFRA (8/36，22.2%)、CCND3 (8/36)融合基因改变分列前三位。生存分析结果显示，全组患者整体预后较差，中位OS为15.7月，有丝分裂指数高、淋巴结转移、BRAF突变及NRG1缺失能明显缩短生存期，差异具有统计学意义，P值分别为：0.044、0.045、0.008、0.001。
该试验仅入组36例患者，却已是关于RMM样本量最大的研究，再一次证实了以下两点：1. 黏膜黑色素瘤基因突变图谱不同于皮肤；2. BRAF突变和NRG1缺失频率虽明显低于皮肤，却是独立的预后不良因素，是RMM潜在治疗靶点。对于黏膜黑色素瘤这个具有中国特色的瘤种，还有很长的路要走，不同发病部位的黏膜黑色素在病理特征、基因背景、整体预后方面是否一致，需要更大样本量、更高级别的临床试验数据去揭示。
图2. OS的Kaplan-Meier生存曲线。A. BRAF突变与较短OS显著相关（P=0.008）。B. NRG1基因型CNVs缺失与较短 OS显著相关（P=0.001）
表2. OS相关危险因素的多因素分析
3. PTENP1-AS与BRAF抑制剂耐药机制及III期黑色素瘤患者的不良预后相关
研究目的与方法：BRAF抑制剂 (BRAFi) 选择性地靶向抑制驱动基因BRAF V600E/K，对80%携带V600突变的晚期皮肤恶性黑色素瘤有效。然而，获得性耐药的出现限制了BRAFi的临床疗效。我们需要了解耐药过程中潜在的分子学特征，以进一步改进治疗。我们在既往研究中发现PTEN的转录受到PTEN假基因反义 RNA，即PTENP1-AS的负调控，本研究旨在探索该转录过程对黑色素瘤的临床预后和 BRAFi 耐药的影响。
研究结果：我们观察到BRAFi 耐药细胞中PTENP1-AS的表达水平增加，与PTEN启动子附近EZH2和H3K27me3的富集相关，从而降低了PTEN的表达水平。此外，我们发现靶向PTENP1-AS转录物使耐药细胞对BRAFi的治疗重新恢复敏感，并且PTENP1-AS在 III期黑色素瘤中的高表达与较差的生存结局相关。
研究结论：总的来说，本研究结果表明，PTENP1-AS是使耐药细胞对BRAFi重新恢复敏感的潜在靶点，同时也可能是 III 期黑色素瘤临床结果的预后标志物。
图3. a）PTEN，total-AKT和p-AKT在A375细胞系以及对BRAFi耐药的细胞系中蛋白表达的Western Blot结果；b-c）PTEN,PTENP1-AS在A375细胞系以及对BRAFi耐药的A375PR1细胞系的qRTPCR结果；d-e）敲掉PTENP1-AS对PTEN表达的影响。通过qRTPCR法测量PTENP1-AS和PTEN在A375PR1（d.）细胞系和A375细胞系（e.）中的表达。
图4. C/EBPB 对PTENP1-AS的调节。
a) qRTPCR 测量 C/EBPB 的表达水平 (n>3)。
b) 随后通过 qRTPCR测量 PTENP1-AS 启动子处的 C/EBPB 水平（n=3）。
c）qRTPCR测量在siRNA诱导的C/EBPB敲除后A375PR1细胞中C/EBPB和PTENP1-AS的表达水平（n=3）。
图5. 评估PTENP1-AS表达与黑色素瘤患者预后的关系。
a) 采用qRTPCR 测量来自III期黑色素瘤患者（n=20）的第一个区域淋巴结转移中PTENP1-AS的表达水平。根据临床随访数据，患者被分类为长期生存（OS＞60个月）或短期生存者（OS≤ 13个月）
b) Kaplan-Meier图显示具有高（n=12）或低（n=17）PTENP1-AS表达水平的患者的总生存期。使用 qRTPCR 在来自一组独立的 29例III期黑色素瘤患者的第一个区域淋巴结转移中测量PTENP1-AS的表达水平。
4. 黑色素瘤患者BRAF等位基因高突变频率与病理特征及靶向治疗反应的相关性
研究背景：BRAF突变的黑色素瘤患者通常接受抗BRAF靶向治疗。然而，许多因素，包括BRAF突变细胞的百分比，可能导致患者结局的巨大差异。
患者和方法：通过焦磷酸测序评估327例不同疾病分期的原发性或转移性黑色素瘤病灶的BRAF等位基因突变频率（VAF；定义为突变等位基因的百分比）。然后将BRAF突变率和VAF与黑色素瘤病理特征以及患者的临床特征进行相关性分析。采用Kaplan-Meier曲线分析经BRAF抑制剂/MEK抑制剂治疗的62例转移性进展患者BRAF的VAF、OS和PFS之间的相关性。
研究结果：确定了高度异质性BRAF VAF（3%~90%）。除与年龄相关外，较高的BRAF VAF水平与中度淋巴细胞浸润（P=0.017）、黑色素瘤Clark分级的厚度（V级与III级，P=0.004；V级与IV级，P=0.04）、淋巴结转移而非皮肤（P=0.04)或内脏（P=0.03）转移灶相关。尤其是，BRAF VAF>25%与接受BRAF抑制剂/MEK抑制剂药物联合治疗的患者的有利结局显著相关（OS P=0.04；PFS P=0.019)，在多变量分析中为OS和PFS独立因素的预后因素（分别为P=0.014和P=0.003）。
研究结论：这些结果明确支持BRAF VAF潜在作为BRAF靶向治疗背景下黑色素瘤患者预后和疗效预测生物标志物。
BRAF突变是黑色素瘤中最高频的突变，近年来针对BRAF V600位点所开发的靶向药物如维莫非尼、达拉非尼，通过靶向结合于突变位点，发挥终止细胞生长信号传导、杀伤肿瘤的目的。针对MAPK信号下游MEK位点的抑制剂曲美替尼、考比替尼，能和BRAF抑制剂联合应用，提高有效率，延缓耐药发生。但无论是达拉非尼+曲美替尼的COMBI-d/v研究，还是康奈非尼+比美替尼的COLOMBUS研究，尽管纳入的都是BRAF V600E/K突变的病人，客观缓解率并没有达到100%。也就是说有一部分病人显示了对双靶的原发耐药，一部分研究提示共突变的存在抵消了双靶治疗的疗效，比如说抑癌基因PTEN、TP53的功能改变，导致了旁路激活的发生，降低了针对MAPK通路靶向抑制所带来的疗效。
当然，影响黑色素瘤靶向药物治疗效果的原因还有很多，本研究创新性地引入了变异等位基因频率（VAF）的概念，定义为肿瘤组织中同一等位基因的突变频率，类似于肿瘤异质性和肿瘤突变丰度的概念，从相对宏观的维度去揭示部分病人靶向治疗效果差的原因。假设黑色素瘤患者肿瘤组织中BRAF VAF的不同与临床病理特征、靶向治疗效果有关，通过回顾327例黑色素瘤患者的临床和病理资料，采用焦磷酸测序法检测62例BRAF突变患者的组织标本，计算出BRAF VAF，并结合既往文献资料，将25%列为高低VAF的界值。
最终的结果提示，BRAF VAF可以作为黑色素瘤预后及对靶向药物疗效的预测指标。高BRAF VAF常发生于易于受紫外线照射的头皮及面部皮肤，而低BRAF VAF水平常见于发生于眼球和肢端的黑色素瘤。高BRAF VAF显示出对靶向治疗特别是双靶治疗更好的疗效，中位PFS 8个月（P=0.004），中位OS 15个月（P=0.007），而低BRAF VAF患者无论对单靶还是双靶都显示出较低的生存获益。高BRAF VAF还被证实和肿瘤厚度有关（Clark V），P=0.001。
这篇文献的意义在于，研究靶向药物耐药机制时，我们应该在高度关注伴随突变所导致的旁路激活以及MAPK通路突变再激活的同时，从另外一个维度来思考问题。同为BRAF V600突变，原发部位不同、肿瘤厚度不同、转移部位不同、肿瘤组织VAF不同，应用诸如达拉非尼+曲美替尼双靶治疗的效果可能不同，基线的BRAF VAF检测，可以作为预后和对双靶药物疗效的预测指标。
图6. 低、高VAF患者生存曲线(界限值25%)，图A为OS, 图B为PFS
5. BRAF、MEK和CDK4/6抑制剂的免疫调节作用：靶向联合免疫治疗黑色素瘤的意义
摘要：近几年出现的靶向和免疫疗法已经彻底改变了黑色素瘤临床治疗，并对转移性黑色素瘤患者预后产生积极影响。对目前的标准靶向治疗方案（BRAFi/MEKi双靶）产生了耐药性的大多数患者尝试联合CDK4/6抑制剂以期实现肿瘤进一步抑制。基于可期的临床前数据，BRAFi、MEKi和CDK4/6抑制联合疗法在BRAF V600突变黑色素瘤中已启动临床试验。有趣的是，BRAFi和MEKi靶向疗法最初开发基于其强大的肿瘤内抑制作用，而后来发现它有显著的免疫增强活性。最近的研究也发现CDK4/6抑制剂在肿瘤免疫相关的影响，但仍未确证其作用为免疫增强或抑制。BRAF V600突变黑色素瘤患者同时可入组靶向和免疫治疗临床试验，包括应用抗PD-1单抗和抗CTLA-4单抗的研究。BRAFi/MEKi靶向治疗的免疫调节活性促使研究者尝试将其与免疫检查点抑制剂进行联合探索。然而最近的临床试验数据的结论却不相一致。在这里，我们总结了BRAFi、MEKi和CDK4/6抑制剂的免疫调节作用，阐明了联合应用以及与免疫检查点抑制剂联合应用的前景。了解这些现有疗法的临床疗效的机制是优化新的联合方案和序贯治疗的基础，对黑色素瘤患者治疗和预后改善至关重要。
图7. BRAF/MEK抑制剂在黑色素瘤BRAF位点的免疫调节作用
(A) BRAF V600通过肿瘤内生性激活MAPK/ERK信号，增加免疫抑制细胞因子的产生来促进肿瘤进展。MAPK/ERK信号中，BRAF V600驱动突变激活与肿瘤微环境中Tregs和MDSCs频率增加有关。在T细胞中，RAF没有过度活跃，也没有异常的MAPK/ERK信号。(B) BRAF和MEK抑制剂通过阻断BRAF V600肿瘤细胞中的MAPK/ERK信号通路，诱导免疫原性细胞死亡。抑制MAPK/ERK可促进肿瘤细胞上调MHC I，并促进黑色素瘤相关抗原的表达，还与肿瘤微环境中T细胞和促炎细胞因子频率增加有关。BRAF抑制还与包括Treg和MDSCs在内的瘤内免疫抑制细胞减少有关。在T细胞和其他BRAF野生型细胞中，BRAF位点抑制通过RAF二聚体和二聚体依赖的酶反相激活促进了MAPK/ERK的反常激活，提高了这些细胞的增殖和存活。
MDSC, 髓系来源抑制细胞; Treg, 调节性T细胞。
图8. 抑制CDK4/6位点的免疫调节作用
(A) CDK4/6抑制剂通过多种机制调节抗肿瘤免疫。在肿瘤细胞中，CDK4/6抑制导致RB低磷酸化（RB结合并抑制E2F转录因子的活性）。E2F活性下降诱导III型干扰素(IFN)，导致干扰素旁路信号出现和MHC I上调。干扰素的诱导源于DNMT1 (E2F目标基因) 抑制，这样可以减少内源性逆转录病毒(ERV)基因的甲基化，从而促进其表达和诱导病毒伪装。低磷酸化的RB也促进NFkB的激活以及随后T细胞诱导和PD-L1的上调。(B)抑制CDK4/6还可以抑制PD-L1下调，进一步增强细胞表面PD-L1蛋白的表达。在T细胞中，NFAT活性被CDK4/6介导的磷酸化抑制。CDK4/6抑制后，低磷酸化的NFAT易位到细胞核并上调效应基因的表达。与其他淋巴细胞相比，T调节细胞似乎特别容易受到CDK4/6抑制的抗增殖作用的影响。
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