众所周知，肺癌是全球头号杀手。作为发病率和死亡率均位居全球首位的癌种，肺癌的研究数量和研究成果一直引领着各大癌种治疗进展的步伐。近年来肺癌治疗领域取得了快速的进展，也极大地丰富了肺癌治疗的方法和手段。为了持续跟踪学术热点和前沿进展，诺华肿瘤医学部启动肺癌文献月评项目，精选肺癌领域最新发表的研究成果，并邀请国内知名专家进行深入解读。本期特别邀请了四川省肿瘤医院李娟教授和云南省肿瘤医院庄莉教授，针对其中2篇为我们带来深入点评。
1. 克服在非小细胞肺癌（NSCLC）治疗中序贯多种ALK抑制剂后出现（I1171S + G1269A）复合突变的耐药问题[1]
间变性淋巴瘤激酶（ALK）融合基因在NSCLC中的检出率约为3%～5%。ALK抑制剂对ALK阳性NSCLC有很高的应答率。然而，获得性耐药不可避免。这项研究探讨了能克服克唑替尼、阿来替尼和劳拉替尼序贯治疗后出现耐药的药物，特别是复合突变之后。
来自日本的研究者们对临床病例的肝活检组织进行新一代测序（NGS）和Sanger测序。制备过表达突变EML4-ALK的Ba/F3细胞，并进行细胞活力检测和免疫印迹法检测五种不同ALK抑制剂的敏感性。
研究者通过NGS和Sanger测序，从一名接受克唑替尼、阿来替尼、劳拉替尼治疗后复发的患者的肝活检组织中鉴定出I1171S + G1269A双突变。在细胞系模型中，塞瑞替尼和布加替尼对复合突变有活性，而其他ALK抑制剂则无效（图1）。
综上，采用序贯ALK抑制剂治疗，除了之前获得的突变外，癌细胞还会出现新的突变。本研究发现确定的复合突变（I1171S + G1269A）对塞瑞替尼和布加替尼敏感。临床上也证实该患者的肿瘤对塞瑞替尼有应答，口服该药750mg后疾病稳定时间长达4个月。（PMID：31943796）。
图1.塞瑞替尼和布加替尼抑制了I1171S + G1269A双突变的Ba/F3细胞。（a-e）Ba/F3 EML4-ALK野生型细胞、I1171S细胞和I1171S + G1269A细胞用指定浓度的克唑替尼、阿来替尼、劳拉替尼、塞瑞替尼和布加替尼处理。使用CellTiter-Glo检测分析细胞活力（f）应用免疫印迹分析指定浓度的ALK TKI处理的EML4-ALK-WT细胞、I1171S细胞和Ba/F3 I1171S + G1269A细胞，在塞瑞替尼和布加替尼处理的含有复合突变的细胞中，ALK磷酸化受到抑制。
四川省肿瘤医院肿瘤内科中心临床研究标准化治疗病区主任
美国梅奥诊所访问学者
现任中国抗癌协会肿瘤转移专委会委员
中国抗癌协会肺癌专委会青年委员
四川省医学会循证医学专委会常务委员
四川省抗癌协会老年肿瘤治疗专委会副主任委员
四川省抗癌协会肺癌专委会常务委员
《中国肺癌杂志》青年编委
ALK基因融合被称为NSCLC的“钻石突变”，随着新一代ALK抑制剂不断出现，ALK阳性患者有了更多的可选靶向药物。然而继发耐药突变仍然给临床医生带来不小的挑战。如何制定合理的序贯治疗方案，使靶向治疗获益最大化？在上述研究中，1名接受克唑替尼、阿来替尼、劳拉替尼序贯治疗后复发的患者，肝活检组织中检出I1171S + G1269A双突变，提示我们ALK抑制剂序贯治疗，肿瘤细胞除了之前获得的突变外，可能会出现新的突变，即复合突变。
在这例复合突变的细胞系模型中，仅塞瑞替尼和布加替尼对复合突变敏感。临床疗效也进一步印证了细胞模型的结果，该患者接受口服塞瑞替尼治疗后，肝脏转移灶明显缩小，疾病稳定时间长达4个月。此例是针对耐药机制去排布ALK抑制剂的典型病例。该研究也提示临床医生各类ALK抑制剂对不同突变位点的敏感性不同，我们需要对患者进行个体化治疗。为了能够获得更好的预后，我们需要对每一种药物或治疗策略的耐药机制进行细致的分析。
2. 通过顺序进行DNA和RNA测序优化非小细胞肺癌的突变和融合检测[2]
局部晚期或转移性NSCLC患者通常会接受多个致病驱动基因的检测。在大多数实验室中，分子诊断检查包括免疫组织化学（ALK，ROS1和PD-L1检测）、DNA测序，以及用于融合和扩增检测的原位杂交等多种检测方法。尤其随着针对特定融合和外显子跳跃的新药的迅速出现，这些检测步骤使得组织样本消耗殆尽的风险增加。
本项研究评估了肿瘤靶向热点突变DNA测序（DNA NGS）未发现致病性驱动基因突变的患者，使用基于锚定多重PCR的靶向RNA测序（RNA NGS）在鉴定基因融合和外显子跳跃中的优势（图2）。研究对象包括院内和转诊医院的IV期NSCLC，其中包括38.5％的细胞学样本和61.5％的显微切割组织学样本，主要来自空心针活检。比较平行检测（DNA NGS和RNA NGS，队列1，n=198）与顺序检测（先检测DNA NGS，无基因改变的再使用RNA NGS，队列2，n=192）。研究者假设进行顺序检测是最有效的。
研究发现在两个队列中，每个病例最多发现一个致癌驱动基因突变。这与大型的全基因组数据库一致，且表明当在DNA NGS中鉴定出明确的致癌驱动因子时，省略RNA NGS检测是安全的。另外，这种方法使得必需进行RNA NGS检测的病例数降低至53％。然而，对于从不吸烟的肿瘤患者，融合和外显子跳跃突变较为多见（从不吸烟vs 既往/现症吸烟者：32％ vs. 4％，P=0.00）。因此考虑到周转时间更短（中位天数 15天，而平行检测只有9天），平行检测对从不吸烟者优势更明显。
综上，在吸烟相关的NSCLC中，DNA NGS和RNA NGS顺序检测是突变和融合检测的最有效策略。而对于从不吸烟者，建议采用平行检测的方法。这种方法在包括细胞学在内的小组织样本中显示出可行性，并且可以大大降低分子诊断检测的复杂性和检测成本，同时在NSCLC中不断变化的靶标格局中具有灵活性。（PMID：32014610）。
图2.队列1（左）：DNA NGS和RNA NGS同时检测。队列2（右）：只有在KRAS、EGFR、BRAF和ERBB2中未发现致病突变，且未发现MET外显子14跳突（包括ERBB2和EGFR扩增）的情况下，才进行RNA NGS。在这两个队列中，在进行分子分析之前，对ROS1、ALK和PD-L1进行免疫组化染色。
云南省肿瘤医院姑息医学科/综合科 主任
云南省姑息医学研究中心负责人
云南抗癌协会癌症康复与姑息专业委员会主委
中国教育协会消化道肿瘤专委会常委
中国抗癌协会心理专业委员会委员
中国抗癌协会支持专业委员会骨髓保护学组副组长
云南省肺癌防治协会分子靶向专委会常委
云南省抗癌协会肿瘤精准治疗专委会常委
云南省肺癌防治联盟委员
中国肺癌防治联盟云南省分盟委员
云南省医师协会呼吸专业委员会常委
云南省抗癌协会肿瘤康复会常委
云南省抗癌协会肺癌专业委员会委员
目前局部晚期或晚期NSCLC患者，尤其是非吸烟的患者，推荐接受多个致病驱动基因的检测，包括EGFR、ALK、ROS1、BRAF、MET、NTRK等。精准治疗极大地改善了晚期肺癌患者的预后。为了满足更广泛的分子诊断需求，DNA和RNA测序近年来发展迅速。NGS不仅可以指导携带敏感驱动基因突变患者的精准治疗，对于一些少见突变和靶向治疗耐药的患者，在探寻潜在的靶向治疗或了解耐药机制方面也起到了重要的作用。
从这项来自荷兰莱顿大学医学中心的研究可以看出，非吸烟患者，融合和外显子跳跃突变较多见（MET 14外显子跳跃突变），为节省病理检测周转时间，推荐同时进行DNA NGS和RNA NGS。然而，对于吸烟患者，可以先行DNA NGS检测，根据检出情况再考虑是否加用RNA NGS。
文中分析了多个融合基因，我们先以ALK融合基因为例，其最常见的融合变体是EML4-ALK，但还存在其他比较少见的融合变体，诸如STRN3-ALK和RPTOR-ALK融合变体，其中RPTOR-ALK融合蛋白为非活跃蛋白，常规IHC检测是阴性的，推荐加做RNA-NGS辅助检测。当ALK IHC呈强阳性时，临床可不需等待DNA NGS或RNA NGS结果就开始靶向治疗；但ALK IHC染色呈弱阳性时，可加做RNA NGS识别出假阳性报告。
而MET14外显子跳跃突变是在内含子13的剪接受体位点或在内含子14的剪接供体位点发生，由于DNA NGS panel有时并未包含完整的剪接区域，影响检出率，这时加做RNA NGS就非常必要。另外MET 14外显子跳突和基因融合通常都不会和诸如PIK3CA，HRAS，MAP2K1，MAP2K4，FGFR1，GNAS，NRAS等罕见基因改变共同发生，所以出现上述罕见突变时加做RNA NGS需要慎重。
为明确这些罕见驱动突变的互斥性，临床需要累积更多的NSCLC分子诊断经验，最终达到简化检测步骤，快速而灵活诊断。
3. ROS1重排非小细胞肺癌与静脉血栓栓塞发生率高相关：Ⅱ期，前瞻性，多中心，双臂试验（METROS）分析[3]
既往研究发现，癌症患者罹患静脉血栓栓塞症（VTE）的风险增加，8％～15％的晚期NSCLC患者在疾病过程中发生VTE事件。目前VTE在分子分型确定的NSCLC亚组中的发生率尚不明确。在这项研究中，研究者通过METROS试验（NCT02499614）探讨ROS1重排的NSCLC患者中VTE的发生率和临床相关性。
METROS试验是一项前瞻性Ⅱ期研究，旨在评估克唑替尼在ROS1重排（队列A）和MET扩增或MET外显子14突变（队列B）的经治转移性NSCLC患者中的疗效性、安全性和耐受性。纳入队列A的ROS1重排NSCLC患者和试验的扩展队列纳入主要分析。
在METROS研究纳入的48例ROS1重排的NSCLC患者中，有20例（41.6％）发生了至少1次VTE事件，其中又有7例（35％）发生≥2个VTE事件。VTE事件包括肺栓塞（46.4％），深静脉血栓形成（39.2％），肾静脉血栓形成（7.1％），颈内动脉血栓形成（3.5％）和经周围静脉插入的中心导管相关血栓形成（3.5％）。发生VTE事件的患者中，在疾病进展期的占25.7%，在诊断中的占32.1％，在化疗或克唑替尼治疗期间的分别占17.8％和14.2％。
基于以上结果，研究者认为ROS1重排的NSCLC患者中VTE的发生率比以往在NSCLC一般人群中观测到的高3～5倍。有必要开展更大规模的研究以证实本研究的发现，并确定是否应将NSCLC的分子谱纳入风险分级工具和VTE诊断和预防的决策算法中。（PMID： 31607443）。
4. 对1089例中国非小细胞肺癌患者血清肿瘤标志物进行回顾性分析，评估其预测EGFR突变及ALK重排的意义[4]
肿瘤标记物（STMs）是否可以成为预测NSCLC患者EGFR突变和ALK重排的有效、非侵袭性方法，目前尚无定论。本研究系统性回顾了2012年1月至2016年12月期间华中科技大学同济医学院附属协和医院的1089例NSCLC患者，他们在治疗前接受了EGFR或ALK基因的检测和STMs测量。研究者分析了亚组间几种临床特征和STMs的差异。采用多因素logistic回归分析，以确定EGFR突变和ALK阳性的预测因子。
来自武汉的研究者对EGFR突变与患者的临床特征之间的关系进行分析，发现EGFR突变在女性（63.11%）、不吸烟者（59.69%）和肺腺癌患者（53.87%）中更为常见。血清肿瘤标志物中糖类抗原CA-125、铁蛋白（FERR）、鳞癌抗原（SCC）、细胞角蛋白19可溶性片段（CYFRA 21-1）水平与EGFR突变显著相关（P<0.05）。多因素分析显示，腺癌、不吸烟状态、CA-125和SCC阴性是EGFR突变的预测因子（P<0.05）。ROC曲线分析结果显示，曲线下面积为0.715（95%置信区间[CI]: 0.673-0.758）。ALK重排常见于年轻患者（中位年龄:49岁）、女性（8.40%）、从不吸烟者（8.82%）和癌胚抗原阴性者（8.02%）。多因素分析显示，只有年龄和不吸烟是ALK阳性的独立预测因素（P<0.05）。结合这两个因素，ROC曲线的AUC为0.760（95% CI: 0.677-0.844）。
本研究结果提示STMs与EGFR突变状态相关，可以与其他临床因素相结合，提高对NSCLC患者EGFR突变状态的识别能力。对于ALK重排患者，年龄和不吸烟状态可以预测突变状态，而STMs不能。（PMID：31707279）。
5. 非小细胞肺癌EML4-ALK融合基因在不同检测方法及标本中检测阳性率的比较[5]
本研究的目的是评价免疫组化、逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）和新一代测序（NGS）方法检测NSCLC的组织标本中EML4-ALK阳性率的差异。此外，比较新一代测序（NGS）方法检测血液样本和组织样本中EML4-ALK阳性率的差异。研究结果为选择合适的EML4-ALK融合基因检测方法提供了依据。
来自中国的研究者对2631例NSCLC患者的组织标本进行EML4-ALK的免疫组化分析；采用RT-PCR检测399例NSCLC组织标本中EML4-ALK的突变；采用NGS检测1505例NSCLC患者EML4-ALK基因突变，其中组织样本1208例，血液样本297例。
研究结果发现免疫组化检测EML4-ALK阳性率为7.11%（187/2631）。从组织学分型分析：肺腺癌EML4-ALK的阳性率为9.51%（170/1787），鳞状细胞癌的阳性率为2.01%（17/844）。经RT-PCR检测，399例NSCLC患者EML4-ALK阳性率为8.52%（34/399），其中腺癌的阳性率为11.62%（33/284），鳞状细胞癌的阳性率为0.86%（1/115）。使用NGS检测，1208例NSCLC组织标本中，EML4-ALK阳性率为4.88%（59/1208），其中腺癌阳性率为5.84%（58/994），鳞癌阳性率为0.47%（1/214）。RT-PCR检测EML4-ALK的阳性率高于免疫组化检测。与NGS相比，免疫组化和RT-PCR检测EML4-ALK阳性率更高，差异有统计学意义（P<0.05）。在297例NSCLC患者的血液标本中，NGS检测到的EML4-ALK阳性率为3.70%（11/297），其中腺癌的阳性率为3.82%（10/262），鳞状细胞癌的阳性率为2.86%（1/35）。因此，组织标本的EML4-ALK阳性率高于血液活检标本。
综上，在三种EML4-ALK检测方法中，RT-PCR阳性率最高，其次为免疫组化，NGS阳性率最低。NGS法检测组织标本中EML4-ALK阳性检出率高于血液标本。（PMID：32047559）。
6. 非小细胞肺癌中18F-FDG PET/CT代谢参数，临床特征与ALK或ROS1融合的相关性[6]
本研究旨在探讨NSCLC中18F-FDG PET/CT代谢参数，临床特征与ALK或ROS1融合的相关性。
研究者纳入了806例EGFR野生型患者，在治疗前进行ALK或ROS1融合检测和18F-FDG PET/CT检查。分析了ALK或ROS1融合与临床特征及PET/CT参数的关系。采用多因素logistic回归分析，探讨ALK和ROS1融合的独立相关因素。
最终82例患者（11.7%）检测到ALK融合。多因素分析显示，高pSUVmax（原发肿瘤）≥10.6、原发肿瘤部位低糖酵解（pTLG）<101.8、年轻、不吸烟、高CEA水平与ALK融合相关。单纯高pSUVmax（原发肿瘤）和其他5个因素联合预测ALK融合的受试者工作特征曲线（ROC）的曲线下面积（AUC）分别为0.603和0.873。26例患者（5.6%）为 ROS1融合。多因素分析显示，高pSUVmax（原发肿瘤）≥8.8、年轻、不吸烟与ROS1融合相关。单纯高pSUVmax（原发肿瘤）和其他3个因素联合预测ROS1融合的AUC分别为0.662和0.813。
本研究表明，18F-FDG PET/CT代谢参数及其他临床参数与NSCLC ALK和ROS1阳性有相关性，可能有助于优化患者进行靶向治疗之前的基因检测。（PMID：31897590）。
1.Takahashi K,Seto Y,Okada K,et al.Overcoming resistance by ALK compound mutation (I1171S + G1269A) after sequential treatment of multiple ALK inhibitors in non-small cell lung cancer[J].Thorac Cancer,2020,11(3):581-587.
2.Cohen D,Hondelink LM,Solleveld-Westerink N,et al.Optimizing mutation and fusion detection in NSCLC by sequential DNA and RNA sequencing[J].J Thorac Oncol,2020,pii:S1556-0864(20)30093-9.
3.Chiari R,Ricciuti B,Landi L,et al.ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer is associated with a high rate of venous thromboembolism:analysis from a phase Ⅱ,Prospective,Multicenter,Two-arms Trial(METROS)[J].Clin Lung Cancer,2020,21(1):15-20.
4.Wang S,Ma P,Ma G,et al.Value of serum tumor markers for predicting EGFR mutations and positive ALK expression in 1089 Chinese non-small-cell lung cancer patients:A retrospective analysis[J].Eur J Cancer,2020,124:1-14.
5.Lu S,Lu C,Xiao Y,et al.Comparison of EML4-ALK fusion gene positive rate in different detection methods and samples of non-small cell lung cancer[J].J Cancer, 2020,11(6):1525-1531.
6.Ruan M,Liu L,Wang L,et al.Correlation between combining 18F-FDG PET/CT metabolic parameters and other clinical features and ALK or ROS1 fusion in patients with non-small-cell lung cancer[J].Eur J Nucl Med Mol Imaging,2020.
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