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Front Med：EGFR通路或介导晚期HCC对瑞戈非尼耐药，联合用药将成突破口

08月11日

整理：肿瘤资讯

来源：肿瘤资讯

对于诊断时已经处于晚期、失去手术切除或肝移植等潜在根治性治疗手段的肝细胞癌（HCC）患者，其治疗往往以靶向治疗、免疫治疗等全身治疗为主。此前，瑞戈非尼已经获批适用于HCC的二线治疗，在临床研究中，瑞戈非尼是首个获国家药品监督管理局（NMPA）批准在索拉非尼治疗失败后对不可切除HCC患者显示出生存获益的药物。然而，目前针对HCC中瑞戈非尼获得性耐药的研究较少，明确其耐药机制对于后续治疗策略的探索具有重要意义。

近期，一项研究通过逐步剂量递增法建立了瑞戈非尼耐药的HCC细胞系，通过蛋白质组学分析识别了异常激活的通路，并评估了通过抑制旁路信号逆转耐药的可行性^[1]。

研究方法

研究者在人HCC细胞系SMMC-7721和MHCC97H中，使用逐渐增加浓度的瑞戈非尼进行处理超6个月，分别建立获得性瑞戈非尼耐药的HCC细胞（97H-R和7721-R），采用高通量蛋白质组学技术鉴定获得性瑞戈非尼耐药细胞与亲本细胞之间与旁路激活相关的差异蛋白。通过直接显微镜观察、CCK-8实验、克隆形成实验、Annexin V-FITC/碘化丙啶双染实验、细胞周期分析、Western blot以及异种移植模型等方法，在体外和体内评估EGFR旁路抑制逆转耐药的能力。

研究结果

EGFR在瑞戈非尼耐药HCC细胞系中过表达

研究者通过逐步剂量递增法，利用MHCC97H和SMMC-7721细胞系建立了瑞戈非尼耐药HCC细胞系，分别命名为97H-R和7721-R。基于高通量蛋白质组学分析，研究者鉴定出MHCC97H和97H-R细胞之间的差异表达蛋白（DEPs）并生成热图，显示耐药细胞与亲本细胞之间蛋白表达存在显著差异。基因本体（GO）富集分析显示，DEPs主要富集在细胞分裂的细胞组分（CC）亚类中。

其中，值得关注的是EGFR，97H-R细胞中EGFR的蛋白水平是MHCC97H细胞的2.46倍，对比亲本细胞，瑞戈非尼耐药细胞中EGFR的蛋白表达显著上调（p < 0.001）。这些结果提示EGFR可能介导HCC中对瑞戈非尼的耐药性。

图1. 瑞戈非尼耐药HCC细胞与亲本细胞中EGFR的表达水平。（A）亲本细胞与瑞戈非尼耐药HCC细胞之间DEPs的火山图。（B）DEPs的GO富集分析。（C）与MHCC97H细胞相比，97H-R细胞中与RTK途径相关的过表达蛋白排名前10。（D）通过Western blot检测的亲本和瑞戈非尼耐药HCC细胞中EGFR的蛋白表达水平。

使用吉非替尼进行抑制可恢复瑞戈非尼耐药HCC细胞对瑞戈非尼的敏感性

研究者使用了EGFR-TKI吉非替尼进行逆转耐药的探索，首先通过CCK-8实验评估吉非替尼对97H-R和7721-R细胞活力的影响。单独使用吉非替尼处理48小时，浓度高达20 µM时，对97H-R细胞的活力抑制作用较小，而7721-R细胞的抑制浓度为10 µM，然而，当与瑞戈非尼联合使用时，97H-R细胞在20 µM吉非替尼处理48小时后活力下降（7721-R细胞为10 µM吉非替尼）。在补充吉非替尼后，97H-R和7721-R细胞对瑞戈非尼的IC50值也有所降低，这些结果提示，抑制EGFR可以逆转HCC细胞对瑞戈非尼的耐药性。

吉非替尼与瑞戈非尼联合应用在体外表现出强大的抗肿瘤活性

研究者进一步评估了吉非替尼与瑞戈非尼联合治疗在体外的抗肿瘤效果。结果显示，当97H-R和7721-R细胞暴露于瑞戈非尼和吉非替尼的联合应用中时，细胞数量和细胞状态均有所减少，相比之下，单独使用瑞戈非尼或吉非替尼对这两种细胞系的细胞数量或细胞状态影响较小。与其它组相比，联合治疗组的凋亡细胞比例显著更高（97H-R：p < 0.001；7721-R：p < 0.001）。此外，联合治疗增加了细胞在G1期的停滞数量，并减少了97H-R和7721-R细胞的克隆形成。结果显示，抑制EGFR可能会减少HCC细胞对瑞戈非尼的耐药性。

在裸鼠模型中，吉非替尼可逆转瑞戈非尼耐药HCC的生长

研究进一步探讨了吉非替尼抑制EGFR是否可在用97H-R细胞建立的裸鼠异种移植模型中逆转瑞戈非尼的耐药性。相比对照组，单独使用瑞戈非尼或吉非替尼治疗产生了较轻的肿瘤抑制效果，而两种药物的联合应用显著抑制了肿瘤生长。肿瘤的体积和重量证实了额外使用吉非替尼可以使瑞戈非尼耐药HCC肿瘤对瑞戈非尼治疗重新敏感化，提示了吉非替尼与瑞戈非尼的联合治疗在体内具有强大的肿瘤抑制效果。进一步的探索结果则显示，EGFR过表达或通过激活RAS/RAF/ERK信号通路促进瑞戈非尼耐药。

图2. 瑞戈非尼和吉非替尼联合治疗对瑞戈非尼耐药HCC细胞增殖和凋亡的影响。（A）瑞戈非尼耐药HCC细胞用吉非替尼和瑞戈非尼处理48小时的细胞形态。（B）使用Annexin V-FITC/PI双染实验检测凋亡率。（C）通过流式细胞术分析细胞周期分布。（D）通过克隆形成实验评估细胞增殖。（E）通过Western Blot检测Bcl-2、裂解的PARP、细胞周期蛋白D1、CDK2和CDK4的表达水平。

研究结论

获得性耐药是癌症治疗中的严峻挑战，限制了患者从TKI治疗中的获益。对于接受瑞戈非尼治疗的HCC患者，多种机制可能介导了其耐药，包括免疫抑制、肠道微生物菌群和氧化应激等。本次研究首次证实了EGFR在HCC中可能通过激活RAS/RAF/ERK通路介导HCC细胞对瑞戈非尼的获得性耐药。此外，EGFR的选择性抑制剂吉非替尼显示出临床应用潜力，或可增强瑞戈非尼耐药HCC细胞对瑞戈非尼的敏感性。研究中，瑞戈非尼与吉非替尼的联合应用抑制了瑞戈非尼耐药HCC细胞的增殖，并促进了细胞凋亡，提示通过吉非替尼抑制EGFR有可能克服瑞戈非尼治疗的获得性耐药。这项研究将为对瑞戈非尼耐药的晚期HCC患者提供新的治疗策略。

参考文献

[1] Hu L, Shi W, Liu K, Ma D, Xin Q, Wang Z, Cao Y, Zhang G. EGFR bypass activation mediates acquired resistance to regorafenib in hepatocellular carcinoma. Front Med (Lausanne). 2024 Nov 13;11:1464610. doi: 10.3389/fmed.2024.1464610. PMID: 39606630; PMCID: PMC11598357.

责任编辑：肿瘤资讯-古木
排版编辑：肿瘤资讯-jyy

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瑞戈非尼与吉非替尼的联合应用抑制了瑞戈非尼耐药HCC细胞的增殖，并促进了细胞凋亡，提示通过吉非替尼抑制EGFR有可能克服瑞戈非尼治疗的获得性耐药