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CPI-0610联合SAHA通过STAT3和p38信号通路诱导弥漫大B细胞淋巴瘤细胞凋亡

11月21日

作者：徐林艳焦俊桑威

单位：徐州医科大学附属医院血液科淋巴瘤中心

来源：Current Medicinal Chemistry

作者简介

桑威

医学博士，副教授，主任医师，博士生导师

徐医附院细胞研究和转化医学中心副主任
徐医附院血液科科副主任,淋巴瘤病区主任
中华医学会血液学分会淋巴细胞疾病学组委员
中国抗癌协会淋巴瘤专委会委员
中国EBV相关疾病工作组秘书长
中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会青年委员
中国抗癌协会血液肿瘤委员会慢淋工作组委员
中国抗癌协会第一届T细胞淋巴瘤工作组委员
中国老年医学会血液学分会淋巴瘤学组委员
江苏省医学会血液学分会青年委员会副主任委员
江苏省淋巴瘤联盟副主席
江苏省医学会血液学分会淋巴瘤学组委员
江苏省“六大人才高峰”“333”人才培养对象
江苏省“科教强卫工程”青年医学人才
国家自然科学基金评审专家

徐林艳

徐州医科大学第一临床学院血液内科

研究背景

尽管免疫疗法大大改善了弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的预后，但仍有一部分患者仍未复发或难治。因此，迫切需要寻找新的治疗靶点和药物。抑制溴结构域和末端外（BET）蛋白一直是各种血液系统癌症的一种有前途的治疗策略。CPI-0610 是一种有效的选择性BET抑制剂。CPI-0610在DLBCL细胞中的作用尚未报道。

研究目的

本研究的目的是评估CPI-0610在DLBCL中的作用及其潜在机制。

研究方法

用CPI-0610处理DLBCL细胞，然后测定细胞活力、细胞周期、细胞凋亡、自噬和特异性细胞信号通路。此外，免疫缺陷小鼠植入SUDHL2细胞，然后用CPI-0610处理以分析肿瘤负荷。我们还分析了CPI-0610与组蛋白脱乙酰酶抑制剂亚罗伊-苯胺羟肟酸的协同作用。

结果

本研究证明，CPI-0610通过抑制G1细胞周期并诱导内源性和外源性凋亡途径表现出细胞毒性。此外，CPI-0610降低人DLBCL细胞中BRD4和c-Myc的表达，并影响MAPK、JAK/STAT和AKT信号通路。体内实验表明，CPI-0610增加了DLBCL异种移植模型的原发性肿瘤生长。此外，CPI-0610与次羟基苯胺异羟肟酸联合使用，通过调节STAT3和p38诱导细胞凋亡方面表现出特异性协同作用。

CPI-0610抑制人DLBCL细胞中的细胞增殖

进行CCK-8测定以确定CPI-0610对DLBCL细胞生长的效果并检测这些细胞的活力。CPI-0610以浓度依赖性方式抑制U2932（IC50：6.388 μM，ABC型）、SUDHL2（IC50：8.755 μM，ABC型）、HBL1（IC50：8.796 μM，ABC型）、OCI-LY10（IC50：6.788 μM，ABC型）和WSU DLCL2（IC50：1.493 μM，GCB 型）细胞系（图1B），无论ABC型还是GCB型细胞。

图(1)CPI-0610抑制人DLBCL细胞活力。(A) CPI-0610的化学结构。(B) U2932、SUDHL2、HBL1、OCI-LY10和WSU-DLCL2细胞与指示浓度的CPI-0610孵育48 h。误差条，平均值±SD。** p < 0.01， ** p < 0.001。(此图的更高分辨率/彩色版本可在文章的电子版本中获得)。

CPI-0610在人DLBCL细胞中诱导G1期阻滞

细胞增殖与细胞周期密切相关；因此，我们进行了流式细胞术分析，以研究CPI-0610对DLBCL细胞周期分布的影响。CPI-0610处理使G1期细胞百分比增加U2932、SUDHL2和WSU-DLCL2细胞系，并减少了S期细胞的百分比（图 2A和2B）。Western blot和qPCR检测显示G1-S 相变调节因子（如p21和p27）的水平显著增加，细胞周期蛋白E的水平降低（图2C和2D）。结果表明，CPI-0610通过增加DLBCL细胞中p21和p27的表达并降低cy clin E的表达，将细胞周期阻滞在G1期。

图2 . CPI-0610诱导人DLBCL细胞G1期阻滞。(A) U2932、SUDHL2和WSU-DLCL2细胞分别与0、10和20 μM CPI-0610孵育36 h，进行细胞周期分析。(B)不同细胞周期阶段的细胞百分比由三个独立实验确定。(C-D) U2932、SUDHL2和WSU-DLCL2细胞与0、10和20 μM的CPI-0610孵育48 h，通过实时荧光定量PCR (C)和western blot (D)检测P21、P27和Cyclin E的水平。误差条平均值±SD。* p < 0.05;** p < 0.01;*** p < 0.001。(此图的更高分辨率/彩色版本可在文章的电子版本中获得)。

CPI-0610在人DLBCL细胞中诱导外源性和内源性凋亡信号通路

进行流式细胞术测定以评估对细胞增殖的影响是否与细胞凋亡有关。CPI-0610增加了U2932、SUDHL2和WSU DLCL2细胞的凋亡百分比（图 3A）。此外，还检查了凋亡信号通路的激活。Western blot分析表明，CPI-0610显著增强DR5表达（图 3B）。此外，CPI-0610 激活了 caspase 8和caspase 3，然后裂解了PARP，这是caspase 3的底物（图 3B）。CPI-0610下调抗凋亡蛋白Mcl-1和 Bcl-2的表达，上调促凋亡蛋白Bax和Bim的表达（图 3C）。这些结果表明，CPI-0610诱导DLBCL细胞凋亡并激活外源性和内源性信号通路。

图(3)CPI-0610诱导人DLBCL细胞凋亡，激活外源性和内源性凋亡信号通路。(A) U2932、SUDHL2和WSU-DLCL2细胞分别与0、10和20 μM的pci -0610孵育48 h，流式细胞术检测细胞凋亡情况。将(B-C) U2932、SUDHL2和WSU-DLCL2细胞与0、10和20 μM的CPI-0610孵育48 h，然后收获整个细胞，使用DR5、caspase 8、caspase 3、PARP (B)、Bim、Bax、Bcl-2和Mcl-1 (C)抗体进行western blotting。(此图的更高分辨率/彩色版本可在文章的电子版本中获得)。

CPI-0610 在人 DLB CL 细胞中诱导自噬

用CPI-0610处理三种人 DLBCL细胞系，以确定CPI-0610是否诱导自噬。LC3B的蛋白质和mRNA表达水平是自噬的标志，在U2932、SUDHL2和WSU-DLCL2细胞中均有所增加（图 4A 和 4B）。其他自噬标志物的蛋白水平，如 Atg5和Atg7，在测试细胞中升高（图 4A）。此外，ATG5、ATG7、Beclin-1和 P62的mRNA水平均呈折痕状（图 4B）。这些发现证实CPI-0610在人DLBCL 细胞中诱导自噬。

图(4)CPI-0610诱导人DLBCL细胞自噬。将U2932、SUDHL2和WSU-DLCL2细胞与0、10、20 μM CPI-0610孵育48 h后，使用LC3B、Atg5和Atg7抗体进行western blotting。(B)将U2932、SUDHL2和WSU-DLCL2细胞与0、10、20 μM的CPI-0610孵育48 h，通过实时荧光定量PCR检测LC3B、ATG5、ATG7、Beclin-1和P62 mRNA的表达。误差柱，均值±SD。* p < 0.05;** p < 0.01;*** p < 0.001。(此图的更高分辨率/彩色版本可在文章的电子版本中获得)。

CPI-0610降低BRD4和c-Myc Expres

检通过检测BRD4的表达，分析CPI-0610在DLBCL细胞中细胞毒性作用的分子机制。Western blot结果显示，CPI-0610抑制了U2932、SUDHL2和WSU-DLCL2细胞中BRD4的表达(图5A)。此外，CPI-0610处理后，下游转录因子c-Myc的表达显著降低(图5B和5C)。这些发现与其他报道BRD4影响c-Myc转录的研究一致。

图5 . CPI-0610降低BRD4和c-Myc的表达。(A和C) U2932、SUDHL2和WSU-DLCL2细胞分别与0、10和20 μM的pci -0610孵育48 h，使用BRD4 (A)和C - myc (C)抗体进行western blot。(B)将U2932、SUDHL2和WSU-DLCL2细胞与0、10和20 μM的CPI-0610孵育48 h，通过实时荧光定量PCR检测c-MYC mRNA的表达。误差柱，均值±SD。* p < 0.05;** p < 0.01;*** p < 0.001。(此图的更高分辨率/彩色版本可在文章的电子版本中获得)。

CPI-0610调节MAPK、JAK/STAT和AKT信号通路

对CPI-0610处理的SUDHL2细胞进行RNA序列比较48 h，以进一步探讨 CPI-0610毒性的机制。结果显示4041个基因上调，4943个基因下调（P<0.05）（图6A和6B）。KEGG（京都基因和基因组百科全书）数据库分析确定了候选靶基因之间显著富集的几种途径（图 6C）。根据这些结果，我们进行了实验验证。Western blot 抑制了CPI-0610处理后ERK1/2信号通路磷酸化的抑制（图 6D）。此外，p38的磷酸化在U2932、SUDHL2和WSU-DLCL2细胞中升高(图6D)。JAK/STAT信号通路的活性也进行了探讨。CPI-0610抑制U2932、SUDHL2和WSU-DLCL2细胞中JAK2和STAT3的磷酸化(图6E)。Western blot 检测也显示DLBCL细胞中AKT磷酸化水平降低（图 6F）。这些结果表明，CPI-0610 抑制促存活途径，即ERK1/2、JAK2/STAT3和AKT信号通路，并促进促凋亡p38 MAPK信号通路。

图(6)CPI-0610调控MAPK、JAK/STAT和AKT信号通路。(A) RNA-Sequence检测10 μM CPI-0610处理后SUDHL2细胞基因表达的聚类热图(红色为上调基因;下调基因(绿色)。(B) CPI-0610处理与对照后SUDHL2细胞不同基因数的火山图。(C)通过RNA-序列分析CPI-0610处理SUDHL2细胞后差异表达基因的KEGG通路分类。(D-F) U2932、SUDHL2和WSU-DLCL2细胞与0、10和20 μM的pci -0610孵育48 h，采用p-ERK、ERK、p-p38和p38 (D)、p-Jak2、Jak2、p-STAT3、STAT3 (E)和p-Akt、Akt (F)抗体进行免疫印迹分析。(此图的更高分辨率/彩色版本可在文章的电子版本中获得)。

CPI-0610减少DLBCL的原发性肿瘤生长

使用皮下小鼠模型检查了CPI-0610的体内疗效。将SUDHL2细胞皮下移植到 NPG 小鼠体内，并在原发肿瘤形成后每两天注射一次CPI-0610。CPI-0610治疗不会影响小鼠的体重（图 7A），而与对照组相比，CPI-0610显着抑制了肿瘤生长（图 7B），表明CPI-0610在DLBCL小鼠模型中具有良好的耐受性。CPI-0610还比对照组更有效地减轻了肿瘤的重量和体积（图 7C 和 7D）。H&E 染色显示CPI-0610处理组的组织坏死高于对照组（图 7E）。免疫组化染色用于评估从小鼠中分离的肿瘤的增殖效率。用CPI-0610处理的小鼠中Ki67表达显著降低（图 7E）。结果表明，CPI-0610 在移植模型中通过抑制体内促增殖发挥抗DLBCL作用。

图7. CPI-0610抑制DLBCL原发肿瘤生长。(A-B) NPG小鼠皮下注射SUDHL2细胞(n=5);于CPI-0610治疗后第2天测量体重(A)和肿瘤体积(B)。(c-d)。分离小鼠皮下肿瘤，称重(C)，测量体积(D)， (E)。采用H&E和Ki 67免疫组化染色(200X)对小鼠肿瘤进行分析。* p < 0.05;** p < 0.01;*** p < 0.001。(此图的更高分辨率/彩色版本可在文章的电子版本中获得)。

SAHA增强CPI-0610的促凋亡作用

用CPI-0610单独处理DLBCL细胞以及与SAHA联合处理，以探索SAHA 对CPI-0610促凋亡作用的增强。当用CPI-0610和SAHA的组合处理细胞时，Annexin V染色流式细胞术抑制了细胞凋亡的增加（图 8A 和 8B）。Western blot证实，与CPI-0610或SAHA单独组相比，组合组的caspase 3和PARP裂解的折痕更大（图 8C）。此外，促凋亡蛋白Bax的表达进一步上调，抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-2的表达在组合组中进一步下调（图 8D）。然后，当用SAHA和CPI-0610的组合处理细胞时，探索信号转导通路。Western blot显示CPI-0610和SAHA的组合进一步抑制了STAT3磷酸化并增加了p38磷酸化（图 8E）。这些发现证实SAHA增强CPI-0610介导的细胞凋亡并在信号通路诱导中发挥协同作用。

图8 . SAHA增强CPI-0610在人DLBCL细胞中的促凋亡作用。(A) U2932、SUDHL2和WSU-DLCL2细胞分别用CPI-0610 (10 μM)、SAHA(1µM)或两者联合作用48 h后，采集全细胞，流式细胞术检测Annexin V/7-AAD。(B)凋亡细胞百分比由三个独立实验确定。误差柱，均值±SD。** p < 0.01;*** p < 0.001。(C-E) U2932、SUDHL2和WSU-DLCL2细胞分别用CPI-0610 (10 μM)、SAHA (1 μM)或两者联合处理48 h，然后收获全细胞，使用caspase 3、PARP (C)、Bax、Bcl-2、Mcl-1 (D)、p-STAT3、STAT3、p-p38和p38 (E)抗体进行western blotting分析。(此图的更高分辨率/彩色版本可在文章的电子版本中获得)。

结论

靶向BET可能是治疗DLBCL的有效策略，并可联合抑制组蛋白去乙酰化酶。