引言：非小细胞肺癌（NSCLC）中发生率≤5%的驱动基因变异被称为“罕见变异”。然而，考虑到我国NSCLC庞大的患者基数，≤5%的发生率也意味着大量的“罕见变异”患者。发生率相对较低的驱动基因变异（如HRAS、NRAS、RIT1、ARAF、RAF1和MAP2K1突变，以及ERBB蛋白家族、LTK和RASGRF1基因融合）可以与相对常见的驱动基因变异（如KRAS、BRAF、MET和ERBB家族突变，或ALK、RET和ROS1融合）共有某些结构特征或致癌通路。在过去的5年里，学界识别了大量的NSCLC罕见驱动基因变异，也有大量靶向NSCLC罕见变异的药物获批。2023年2月，Nat Rev Clin Oncol发表了一篇NSCLC罕见分子病理亚型综述，总结了罕见分子亚型流行病学、临床及研究现状，并讨论了未来的努力方向。
背景介绍
现有研究已鉴别出许多种NSCLC罕见分子亚型（图1A），其驱动基因变异发生率可因种族（图1B）、年龄及检测方法（图1C）而异。然而，将NSCLC罕见分子亚型归类为罕见病会低估其对真实世界的影响，其中一些亚型每年可影响全球18,000~90,000人，发病率甚至高于其他几种常见恶性肿瘤（如急性淋巴细胞白血病，以及外阴、骨和男性生殖系统恶性肿瘤）（图1D）。
图1. “罕见”NSCLC发病情况。a, 肺腺癌驱动基因变异流行病学数据；b, 驱动基因变异发生率因人种而异；c, 驱动基因变异发生率因检测方法而异；d, NSCLC“罕见”分子亚型与其他常见恶性肿瘤发病率的对比。
NSCLC罕见分子亚型根据其发病率可分为两类，第一类是实际发病人数和发病率相对常见的亚型，如EGFR 20号外显子、ERBB2、BRAF V600E和MET突变，以及ALK、ROS1、RET和NTRK1/2/3融合阳性NSCLC。第二类是实际发病率较低的驱动基因变异亚型，如KRAS、HRAS、NRAS、DDR2、LTK、RIT1、ARAF、BRAF非V600E、RAF1和MAP2K1突变，其数据相对有限。
可以根据分子特征、致癌和信号通路以及临床病理特征，将NSCLC罕见分子亚型与常见亚型归类，例如编码MAPK蛋白家族成员的基因变异（HRAS、NRAS和RIT1突变），可以与KRAS突变进行归类。
在诊断和治疗时也可以采取相同方法，例如，用于RET和ROS1融合的检测策略同样适用于诊断RASGRF1融合。基于已获批的靶向治疗，许多常见分子亚型被普遍认为是高度可靶向的（actionable）。基于不同级别的临床前和临床证据，不常见的分子亚型也可能是可靶向的。例如，有临床前研究证实靶向ALK融合的酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）也有针对LTK融合NSCLC的活性。
最后，本文概述和讨论了加快NSCLC罕见分子亚型靶向治疗审批的努力和方法。
分子亚型
1.1 突变。罕见基因突变或序列改变可以根据受影响的蛋白质进行分类，一组是编码受体酪氨酸激酶（RTK）的基因突变，包括MET、EGFR、ERBB2和DDR2等。这些基因可以有许多不同的突变形式，但最常见的“罕见”突变是MET 14号外显子变异（NSCLC中发生率为4%）、EGFR 20号外显子突变（NSCLC中发生率为1.4%）、ERBB2 20号外显子突变（NSCLC中发生率为1.4%）和DDR2突变（肺鳞癌中发生率为4%，肺腺癌中发生率为0.4%）。
另一组是编码MAPK信号通路成员的基因突变，包括KRAS、NRAS、HRAS、RIT1、ARAF、BRAF、RAF1和MAP2K1等基因。影响RAS蛋白家族成员的突变包括KRAS（非G12C/V/D突变）、NRAS（NSCLC中发生率为0.9%）、HRAS（NSCLC中发生率为0.1%）和RIT1（肺腺癌中发生率为0.7%）相关突变。因为KRAS G12C、G12V和G12D突变发生率超过罕见分子亚型定义的阈值，故不在本文讨论范围。影响肺腺癌下游信号通路蛋白质的突变包括ARAF（0.2%）、BRAF（4.5%）、RAF1（0.4%）和MAP2K1（0.7%）。
罕见分子亚型也可以按驱动基因变异类型进行分类。KRAS、NRAS、HRAS、RIT1、ARAF、BRAF、RAF1、MAP2K1和DDR2常发生可导致氨基酸序列替换的错义突变。EGFR、ERBB2和MET可发生插入和/或缺失突变。EGFR和ERBB2 20号外显子插入突变在结构上是同源的。ERBB家族成员也可发生激酶区复制（NSCLC中发生率为0.2%），如EGFR 18-25号外显子的串联和框内复制。在其他非ERBB家族基因（如RET和MET）中也发现了激酶区复制，MET 14号外显子变异也包括14号外显子的剪接位点缺失突变。
虽然某些基因更倾向于出现某种特定类型的基因变异，但这些基因也可发生其他类型的变异。例如，KRAS、RIT1、BRAF和MAP2K1常发生点突变，但也可出现缺失突变。与之相反，除了常见的缺失突变外，MET（激酶或信号结构域）和ERBB2（激酶、跨膜或胞外结构域）也可发生点突变。
1.2 融合。基因融合也可以根据受影响的蛋白质进行分类（图2）。其中一组是涉及编码RTK的基因，包括ALK（肺腺癌中发生率为3-4%）、RET（肺腺癌中发生率为1-2%）、ROS1（肺腺癌中发生率为1-2%）、NTRK1/2/3（肺腺癌中发生率<1%）、FGFR1/2/3（肺腺癌中发生率<1%）、EGFR（肺腺癌中发生率<1%）、ERBB2（肺腺癌中发生率<1%）、ERBB4（肺腺癌中发生率<1%）和LTK（肺腺癌中发生率<1%）相关基因融合，这些驱动基因融合通常包括一个完整的激酶结构域。第二组涉及编码MAPK信号通路成员的基因，包括RASGRF1（肺腺癌中发生率<0.1%）和BRAF（肺腺癌中发生率为0.2%）相关基因融合。涉及BRAF的基因融合通常包含激酶结构域，并且在结构上与RTK融合相类似，而涉及RASGRF1的基因融合通常包含具有催化活性的RASGRF1 RAS-GEF羧基末端结构域。另一组涉及编码RTK配体的基因，包括NRG1（肺腺癌中发生率为0.3%）和NRG2融合（肺腺癌中发生率为0.02%）。BRD4（NSCLC中发生率为0.05%）和PKC融合不属于上述三种基因融合类别中的任意一种。尤其是PKC融合，应该被视为一个单独的实体，因为这些融合都是功能丧失性变异。
存在多种不同的激酶融合伴侣基因。一些伴侣基因主要与特定的RTK融合（如EML4与ALK）；另一些伴侣基因，如TRIM蛋白家族成员，可与多个RTK融合（如TRIM24-RET和TRIM24-NTRK2）。伴侣基因可能会影响激酶的结构定位，包括跨膜区（如NRG1或RASGRF1融合）或亚细胞定位（如NTRK1/2/3融合）。伴侣基因也可以通过贡献额外的二聚化结构域（包括卷曲螺旋结构域、锌指结构域、LISH、WDR或SAM结构域）来影响不依赖于配体的二聚化能力。
图2. 基因融合的结构、信号传导和细胞定位。
1.3 拷贝数变异。RTK编码基因ERBB2和MET的扩增在新诊断的肺腺癌患者中发生率分别为0.9%和1.4%，FGFR1和ARAF扩增发生率分别为1%~3%和1%。其他基因拷贝数变异，如EGFR、BRAF和KRAS扩增，较少被描述。染色体或染色体外的DNA同样可以发生基因扩增，这也是EGFR突变肺癌患者对EGFR TKI产生继发性耐药的机制之一。
NSCLC中罕见变异在肿瘤发生中作用机制的证据级别随着变异种类不同而不同。例如，MET 14号外显子跳跃突变致癌机制基本明确，而BRD4基因融合等变异的致癌机制有待进一步研究。
2.1 RTK和RTK配体变异。RTK及其配体编码基因的突变、融合和扩增在功能上集中于RTK及其下游信号通路的激活；这些通路主要包括MAPK、PI3K、PKC和JAK-STAT通路。RTK活化可以以配体依赖的方式发生，也可以以配体非依赖的方式发生。
涉及EGFR、ERBB2、ERBB4、DDR2、ALK、RET、ROS1、NTRK1/2/3和LTK的突变或融合可发生非配体依赖的关键激酶结构域活化。这些突变的RTK可维持其跨膜定位。相反，虽然已知某些RTK融合定位于细胞膜，但许多融合发生于细胞质或其他亚细胞定位。发生位置的差异可以改变下游信号通路的激活。
配体依赖的RTK激活通常发生在剪接变异的情况下。许多MET 14号外显子变异影响了剪接受体和/或供体区域，导致14号外显子跳跃突变。如果缺少MET 14号外显子编码的CBL泛素连接酶结合域，MET蛋白可被循环到细胞表面，而不是被降解。目前研究也已发现ERBB2 16号外显子跳跃突变（ERBB2 Δex16）和FGFR2 18号外显子的截短突变（FGFR2 Δex18）。这些突变分别消除了HER2和FGFR2的调控元件，并诱导了结构性受体二聚化。多种编码RTK的基因（如EGFR、ERBB2、MET、FGFR1和FGFR3）的扩增也发生了配体依赖性的RTK激活。这种扩增可以增加仍受配体结合影响的RTK在细胞表面的受体密度。较高的扩增水平可能继而产生较高的RTK受体水平。
NRG1或NRG2的基因融合产生了保留EGF样结构域的嵌合癌蛋白，该结构域以自分泌或旁分泌的方式结合HER3和HER4。NRG1基因融合产生的嵌合癌蛋白与配体（例如HER2和HER3）结合后发生受体二聚化，导致MAPK、PI3K和FAK信号通路的激活。
2.2 MAPK通路变异。RAS蛋白是一种由核苷酸结合状态决定生物活性的GTP酶。非活性状态RAS-GDP与活性状态RAS-GTP的比值由GDP与GTP循环速率决定。KRAS、NRAS和HRAS突变以及RASGRF1融合可以影响这两种进程中的一种或两种。大多数KRAS、NRAS和HRAS 12号密码子突变可影响GTP水解速率，但不影响GTP合成速率，而13号密码子突变可影响这两种进程的速率。RASGRF1 C-末端结构域融合可催化GDP从RAS蛋白解离。也已发现NF1和RASA1的失活突变；这两个基因都编码Ras GTP酶激活蛋白，负向调控RAS信号通路。最后，RIT1突变已被证明可通过逃避LZTR1介导的降解来激活MAPK信号通路。
编码RAF蛋白家族成员的基因突变可以根据RAS依赖性进行分组。ARAF S214X、BRAF I类（如V600E）和II类突变（如G469A和K601E）以及RAF1突变可导致RAS非依赖性的MAP2K1和MAP2K2激活。BRAF I类突变以单体形式进行信号传导。BRAF融合、ARAF、BRAF II和RAF1突变以二聚体形式进行信号传导。BRAF III类突变（如G466V、D594G和N581S）可导致RAS依赖性激活，与野生型BRAF相比，BRAF III类突变对RAS-GTP有更高的亲和力。RAS–GTP与BRAF III类突变蛋白结合可导致RAF1活性增强，以及激活ERK信号通路，这种情况也可能与其他RAS信号通路的变异同时发生。此外，ARAF扩增可以拮抗NF1结合，以激酶非依赖性的方式激活RAS。
MAP2K1突变可以根据RAF依赖性进行分组。MAP2K1 I类突变（如D67N和P124S）具有RAF依赖性，对信号通路的影响有限，也可以与其他ERK激活变异共存。MAP2K1 II类（如K57N和C121S）和III类改变（如E102_I103del和I103-K104del）是RAF非依赖性的。
2.3 其他变异。BRD4融合已在NUT中线癌中被很好地描述。在NSCLC中，BRD4-NOTCH3融合可能会将组蛋白乙酰转移酶和其他转录辅助因子排除到特定染色体转录区以外（包括MYC）。值得注意的是，这种融合包括NOTCH3的功能锚蛋白结构域，已在其他肿瘤中证实为NOTCH信号通路结构性激活的原因。因此，BRD4和NOTCH3结构域都可能是BRD4-NOTCH3融合促进肿瘤发生的原因。
3.1 临床和组织学特征。RTK、RAS、RAF和MEK相关罕见驱动基因变异在肺腺癌发生率相对较高，而肺腺癌也是NSCLC 最常见的组织学亚型。这些变异也可发生于非肺腺癌组织学类型中，如鳞状细胞癌、大细胞神经内分泌癌，而在小细胞肺癌中发生率较低。例如，DDR2突变、FGFR1扩增和PIK3CA变异在鳞状细胞癌中发生率较高。对于特定的分子亚型，没有哪种病理特征是完全特异的，尽管某些独特的组织病理形态与罕见的分子亚型有关。例如，携带ALK、ROS1或RET融合的肿瘤通常富含细胞外粘蛋白、筛状组织学特征和印戒细胞形态。
NRG1融合常见于侵袭性粘液性腺癌（IMA），是肺腺癌的一种亚型（占肺腺癌的3%），具有不同的临床、病理和分子特征。尽管IMA的发病率很低，但在所有NRG1融合阳性NSCLC中，IMA占相当大的比例（28%）。与KRAS突变相比，NRG1融合阳性的IMA往往恶性风险更高，并与预后不良相关。无NRG1融合的IMA通常携带KRAS突变，特别是G12D/V，以及在非粘液性肺腺癌中发现的其他驱动基因变异（包括非NRG1融合）。
与其他促进有丝分裂的驱动基因不同，MET 14号外显子跳跃突变与几种罕见的NSCLC组织学亚型有关，即肉瘤样癌和腺鳞癌。大多数MET 14号外显子跳跃突变的肿瘤都是肺腺癌，尽管在MET 14号外显子跳跃突变的肺腺癌患者中，肉瘤样和腺鳞癌的组织学频率可能是MET野生型患者的四到六倍。这些组织学也常见于MET高度扩增的NSCLC患者，表明这些组织学倾向与更广泛的MET激活相关。此外，ALK或ROS1融合与NSCLC患者血栓形成风险增加相关。
尽管可能存在种族差异，且对许多罕见驱动基因变异的研究较少，学界已发现许多罕见的致癌基因变异倾向于发生在年轻的、从不吸烟或曾轻度吸烟的患者中。EGFR和ERBB2 20号外显子突变在从不吸烟的亚裔女性中更为常见，基因融合通常发生在几乎没有吸烟史的患者中。相比之下，MET 14号外显子变异通常在有较严重吸烟史（>10包-年）的老年患者（中位年龄72岁），以及吸烟更严重（>20包-年）的患者中被发现。KRAS（如G12A和G13C）和MAP2K1颠换（嘌呤和嘧啶之间的替换）突变（如K57N）可能更常见于既往或当前吸烟者。
3.2 化疗和免疫治疗反应性。根据对化疗的反应性，NSCLC罕见分子亚型可大致分为两组。在第一组中，化疗可以产生长期获益。根据回顾性研究数据，与其他驱动基因变异 （如KRAS或EGFR突变）患者相比，在ALK、ROS1或RET融合阳性NSCLC患者中，含培美曲塞的方案可以产生更高的客观缓解率（ORR）和更长的中位无进展生存期（PFS）。在第二组中，回顾性研究数据提示化疗获益有限，包括BRAF、ERBB2和EGFR 20号外显子突变，以及NTRK1/2/3和NRG1融合等驱动基因变异。
大多数驱动基因变异NSCLC患者对免疫检查点抑制剂（ICIs）单药治疗没有反应（ALK融合患者ORR为0%，但KRAS突变患者ORR为26%），这些患者的中位PFS较短 （RET融合患者为2.1个月，MET 14号外显子突变患者为3.4个月）。ICIs反应性差可能是由于肿瘤微环境免疫原性差、肿瘤突变负荷（TMB）低于驱动基因阴性NSCLC、CD8+T细胞渗透率低和/或其他因素所致。
此外，也有一些ICIs疗效显著的特例，例如，在携带BRAF突变NSCLC中，吸烟者比从不吸烟的患者的PFS更长（4.1个月对1.9个月）。另一个例子是携带MET 14号外显子突变，且PD-L1高表达（肿瘤比例评分≥50%）的转移性NSCLC使用ICIs作为一线治疗的ORR为43%，中位反应持续时间为13.9个月，而PD-L1低表达的患者中位反应持续时间仅为3.5个月。值得注意的是，化疗和免疫治疗在NSCLC罕见分子亚型中的疗效数据主要来源于回顾性小样本队列，限制了数据分析的可靠性。
与仅使用其中一种治疗药物相比，同时或续贯使用ICIs和TKI会增加药物相关毒性。ICI治疗后续贯使用TKI药物可导致转氨酶升高（在接受克唑替尼治疗的ALK融合阳性患者中，45.5%的患者发生3~4级转氨酶升高）和过敏（在接受塞普替尼治疗的RET融合阳性患者中，11.2%的患者出现过敏反应）发生率增加。因此，如果尚未报告分子检测结果，对于疑似驱动基因阳性的NSCLC患者，建议单独使用化疗或ICI中一种方案治疗，而不是化疗联合ICI治疗。
诊断方法
在过去的十年中，罕见驱动基因变异的发现极大地影响了肺癌分子检测实践。以前的基因分型方法仅注重对少数几个基因进行单基因分析（如聚合酶链式反应、荧光原位杂交或桑格测序）。首先分析最常见的变异基因（如KRAS和EGFR），然后分析不太常见的变异基因；依次进行检测，直到发现阳性结果。随着技术的进步和可靶向基因变异的不断增加，诊断规范已经逐渐过渡到下一代测序（NGS），其作为一种更全面、经济和高效的方法。广泛采用更全面的NGS panel，使得可以同时进行更多的基因的测序，既增加了发现罕见变异的可能性，也增加了发现以前未报道变异的可能性。
许多NGS检测被设计为同时检测数百个基因，包括罕见的潜在驱动基因，以前由于这些基因变异发病率有限（如NTRK1/2/3融合）或研究现状（如NRG1或FGFR1/2/3融合）而较少被检测。因为较少进行针对罕见驱动基因变异的独立检测，而且在可获取组织有限的情况下通常难以实施，因此NGS通常为罕见变异提供唯一可行的筛查方法。在常规检测的基因中，NGS可以鉴别不常见的基因变异类型（如20号外显子插入突变，而这种不常见变异可能被一些基于热点基因的PCR分析遗漏）。NGS还能识别多种类型的变异（包括扩增、突变和融合）和潜在的新变异。
2.1 基于RNA的检测。基于DNA的NGS通常是基因分型的主要和/或唯一的检测方法；尽管如此，DNA NGS对融合和选择性剪接转录本的敏感性取决于分析设计、基因覆盖和靶标富集。由于大小限制（NRG1内含子的巨大尺寸导致无法针对其设计足够的覆盖）和重复序列（ROS1 31号内含子由于存在重复的长散布核元件而难以捕获）的存在，内含子（大多数断点发生的区域）的测序可能较为困难。
相比之下，基于RNA的NGS可以直接检测不包含大内含子序列的致癌RNA转录本，从而能够进行更有效和更灵敏的分析。基于RNA的NGS还可以检测DNA测序遗漏的隐匿性激酶融合，从而提高检测灵敏度。此外，基于RNA的NGS提高了检测特异性，因为其可确认在DNA中检测到的某些意义不明的融合是否转录成致癌融合，同时也可发现其他融合产生的新的嵌合转录本。
对于剪接位点的变异，基于DNA杂交捕获的靶向富集法优于基于扩增子的方法。然而，DNA测序仍然存在局限性。如果没有足够的MET内含子覆盖14号外显子，位于内含子深处大的缺失和隐蔽的剪接位点突变（例如位于内含子-外显子连接处10个以上的核苷酸序列）可能会被遗漏。此外，基于DNA的NGS偶尔会发现MET 13和14号内含子中的深处内含子变体，这些内含子对DNA剪接的影响尚不清楚。相比之下，RNA测序可以通过直接捕获异常的剪接副产物来确定导致MET 14号外显子跳跃突变的变异类型。
尽管基于RNA的测序技术对特定突变检测具有优势，但也必须认识到使用RNA作为临床分析物的独特困难。与DNA相比，RNA更不稳定，更容易被降解，导致临床检测失败率为10-30%。RNA测序可优化的检测前策略包括优先选择含有丰富肿瘤成分的样本，避免使用可能产生较低数量和质量RNA的老旧库存样本。
整合基于DNA和基于RNA测序工作流程的共识或方法尚未建立。虽然预先进行基于DNA和基于RNA的双重NGS是一种策略，但这可能不是所有患者都需要或者最优的检测流程，尤其是在资源有限的情况下。另一种策略是使用基于DNA的NGS作为初筛试验，随后在特定患者（例如DNA检测驱动基因阴性和/或携带意义未明的融合或内含子突变）中进行基于RNA的NGS筛查。这一模式侧重于解决基于DNA检测的局限性，并可能有助于更优化、更具性价比地使用基于RNA的检测，尽管续贯检测全流程所需时间更长。
2.2 拷贝数分析。除了融合和剪接位点变异外，由于各种生物学、分析前和分析后因素，使用基于DNA的NGS很难捕获罕见的基因扩增。重要的是，扩增的检测在很大程度上依赖于扩增程度、肿瘤纯度和样本的克隆性。例如，如果含有高水平MET扩增的肿瘤细胞与大量免疫细胞和间质相混合，非肿瘤细胞的优势可能会掩盖MET扩增。
较低水平的扩增和/或仅在小部分肿瘤细胞中存在的扩增会进一步降低敏感性水平。来自稀释性研究的数据表明，在肿瘤细胞含量<20%的标本中，扩增检测的结果可靠性较低。因此，扩增结果为阴性或可疑的低纯度肿瘤样本可能从进一步的FISH检测中获益，因为FISH可以在单个细胞水平提供更准确的分析结果。
由于暂无可靠的扩增阈值和治疗决策指南，对NGS检测结果中拷贝数的解释更为复杂。例如，高水平MET扩增的存在丰富了对MET抑制治疗反应的认知，尽管扩增的定义在不同的检测中可能有很大的不同，并且临床上可以在不同的拷贝状态上看到不同的治疗反应。需要进一步标准化扩增阈值和治疗方案的标准或建议。
2.3 液体活检。足够的肿瘤组织样本对NGS的成功实施是必不可少的；然而，通过侵入性操作获得的样本有时并不足以进行全面检测。使用大约3-10毫升血浆的液体活检和循环肿瘤DNA（ctDNA）分析需要的检测时间更短，当肿瘤组织活检不安全或无法进行时，液体活检可以作为基于组织的肿瘤基因分型的替代方案。尽管ctDNA检测的效用是公认的，但必须考虑几个重要的问题。
考虑到血浆ctDNA的稀缺性和超深度测序的需要（通常大于10,000×深度），液体活检panel通常比基于组织的panel涵盖更少的基因，以便平衡测序广度和深度的需要。因此，较常见的基因变异通常被优先检测，而不太常见的基因变异有时会被排除在ctDNA panel之外。MSK-ACCESS液体活检panel提供了一个例子，该panel涵盖129个基因。相比之下，它的基于组织的等价物MSK-IMPACT在目前的迭代中涵盖505个基因。其他商业用途的基于ctDNA的分析方法，如Guardant360，有一个高度集中的<100个基因的panel；而Tempus xF和FoundationOne Liquid，尽管它们的基因panel更大，但涵盖的基因仍然少于它们基于组织的NGS等价物。
与血浆相比，其他体液（如脑脊液或胸腔积液）可能富含ctDNA，从而能够进行灵敏度较低，但更大和更具包容性panel的NGS检测，这些panel通常用于肿瘤组织的测序。尽管如此，无论来源如何，ctDNA检测都有不同程度的敏感性，所有阴性结果都应该通过肿瘤组织测序来确认。
基于DNA的组织样本NGS分析局限性也适用于基于ctDNA的检测。目前，还没有基于RNA的液体活检临床分析方法可用于肺癌患者（目前基于RNA的融合和外显子跳跃突变检测都基于组织），尽管在循环肿瘤细胞、无细胞RNA和外泌体RNA图谱方面的卓越进展表明，这种分析方法可能在未来进入临床工作常规。
新驱动基因变异的发现
基于DNA和基于RNA的靶向NGS有时无法识别RTK-RAS-RAF通路中的明确驱动基因变异。虽然存在一个独特的驱动基因阴性亚群，其特征是吸烟诱导的恶性肿瘤，且具有复杂的基因组学、高TMB和/或TP53、STK11或KEAP1变异，但靶向NGS未发现驱动基因变异，特别是在低TMB、从不吸烟的人群中，可能是假阴性结果，提示使用全转录组测序（WTS）或全基因组测序（WGS）以进行更全面的分析是合理的。
对所谓“驱动基因阴性”肿瘤进行WTS使发现NRG2、 RASGRF1和LTK融合成为可能。与靶向NGS相比，临床级WTS可能有助于更广泛地寻找其他罕见或新的融合。同样，WGS也可能发现新的驱动基因变异。在TCGA LUAD项目中，对WTS和全外显子组测序鉴定为驱动基因阴性的肿瘤进行WGS，结果发现其存在致病性拷贝数变异、复杂的基因重排和非编码基因变异，包括ILF2启动子区域中的潜在致病性驱动基因突变。此外，WGS能够检测由于肿瘤纯度低和/或覆盖率低而被全外显子组测序遗漏的经典驱动基因变异，从而突出了分析前因素和质量控制的重要性。
虽然临床并不常规使用WTS和WGS，但相关研究数据表明，WTS和WGS在发现驱动基因阴性肿瘤生物标记物方面发挥了全新作用，尤其是此前被认为可能是驱动基因假阴性的肿瘤（如低TMB、非吸烟相关NSCLC）。其他多组学方法（如甲基化组学和蛋白质组学）的潜在效用也在继续研究和发展。
Harada G, Yang SR, Cocco E, Drilon A. Rare molecular subtypes of lung cancer [published online ahead of print, 2023 Feb 20]. Nat Rev Clin Oncol. 2023;10.1038/s41571-023-00733-6. doi:10.1038/s41571-023-00733-6
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