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单细胞测序与空间多组学综合分析揭示B7/CD28家族蛋白在肝细胞癌中的表达特征与预后价值

03月05日

整理：肿瘤资讯

来源：肿瘤资讯

肝细胞癌（HCC）是全球范围内导致癌症相关死亡的主要原因之一，其治疗反应异质性极大限制了免疫检查点抑制剂（ICIs）的临床获益。尽管PD-1/PD-L1通路阻断在部分患者中显示出持久疗效，但单一疗法客观缓解率仅为15%—25%，提示亟须探索新的免疫调控靶点。B7/CD28家族作为免疫检查点的核心分子家族，在维持免疫耐受与抗肿瘤免疫平衡中发挥关键作用。本研究通过整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、转录组学及多色免疫荧光技术，系统描绘了B7/CD28家族在肝癌微环境中的细胞分布与通讯网络，并验证了B7H3（CD276）作为独立预后标志物的临床价值。

图1 研究流程图

研究背景

肝细胞癌占原发性肝癌的85%—90%，其肿瘤免疫微环境（TIME）的复杂性决定了免疫治疗疗效。B7/CD28家族包含B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1（CD274）、PD-L2（PDCD1LG2）、ICOSL、B7H3（CD276）、VISTA（VSIR）等多个成员，分别与CD28、CTLA-4、PD-1、ICOS等受体结合，构建精细的免疫调控网络。既往研究多聚焦于PD-L1的表达模式，但其他B7家族成员在HCC中的系统表达特征及其介导的细胞间通讯仍不明确。单细胞技术的兴起为解析时空异质性提供了可能，但缺乏整合多中心数据与临床队列的系统性研究。本研究旨在填补这一空白，明确B7/CD28家族的预后价值，为精准免疫治疗提供新靶点。

研究方法

单细胞数据整合与质控：本研究从公共数据库获取4个scRNA-seq数据集（GSE136103、GSE168933、GSE125449、GSE149614），涵盖42例肝组织样本（18例HCC，24例正常肝组织），共89246个细胞。使用Seurat v4.0软件进行质控，排除基因数<200或>9000、线粒体基因比例>20%及红系基因>5%的低质量细胞。通过FindVariableFeatures函数筛选2000个高变基因，采用FindIntegrationAnchors方法消除批次效应，最终整合数据用于下游分析。

细胞注释与通讯分析：基于已知谱系标志物手动注释8种细胞类型：肝细胞（ALB、HNF4A）、恶性细胞（GPC3、AFP）、单核细胞（CCR2、S100A8）、巨噬细胞（CD163、CLEC4F）、NK细胞（NCR1、NKG7）、B细胞（CD79A、MS4A1）、T细胞（CD3D、CD3E）及成纤维细胞（COL1A1、FAP）。使用CellPhoneDB v4.0进行配体－受体互作分析，针对B7/CD28家族蛋白特异性构建受体－配体对，通过1000次置换检验计算通讯概率与P值。

预后模型构建：从癌症基因组图谱（TCGA）获取377例肝细胞癌（LIHC）患者的RNA-seq数据（TPM格式）及临床信息，排除随访<30天或生存状态缺失者，最终纳入365例。采用glmnet包进行Lasso-Cox回归分析，筛选与总生存期（OS）最相关的B7家族成员。通过10折交叉验证确定最优λ值，计算风险评分并以中位数分为高风险组与低风险组。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，log-rank检验比较差异，时间依赖性ROC分析评估模型效能。

临床队列验证：回顾性收集2015年3月至2019年9月广东省湛江中心人民医院94例HCC切除患者标本，中位年龄55岁，男性84例。采集临床病理参数包括肿瘤大小、结节数、卫星灶、血管侵犯、AFP水平等。随访截止至2021年8月31日，中位OS为21-40个月，中位无进展生存期（PFS）为30.5个月。采用免疫组化（IHC）检测B7H3表达，以兔IgG同型对照（3900）验证特异性。多色免疫荧光使用TSAP-Plus荧光三重染色试剂盒，DAPI复染核，Olympus IX-71显微镜成像。

统计分析：临床数据采用GraphPad Prism 8.0分析。B7H3表达与临床病理特征的关联采用χ²检验或Fisher精确检验。生存分析使用Kaplan-Meier法，log-rank检验评估组间差异。P < 0.05为统计学显著性。

研究结果

B7/CD28家族在肝癌微环境中的细胞分布特征

整合89246个单细胞数据后，t-SNE降维可视化显示37个细胞亚群。与健康肝组织相比，肝癌组织中巨噬细胞、恶性细胞比例显著升高，而肝细胞比例下降。B7/CD28家族蛋白在巨噬细胞、单核细胞、T细胞、肝细胞、恶性细胞及内皮细胞中呈现差异表达。具体而言，肝癌组织中CD80、CD86、PD-L1、HHLA2、NCR3LG1及B7H3表达上调，而PDCD1、VTCN1、VSIR表达下调，提示肿瘤状态下该家族成员呈动态重塑。

图2 健康肝脏和肿瘤样本

基于B7/CD28家族的细胞间通讯网络

CellPhoneDB分析显示，肝癌组织中巨噬细胞、内皮细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞及NK细胞间的通讯强度显著高于正常肝组织。配体－受体对分析揭示PD-L1-PD-1、CD80-CTLA-4、CD86-CD28、B7H3-TREML2等关键互作在肿瘤细胞与基质细胞间频繁发生。值得注意的是，B7H3作为广泛表达的配体，可与TREML2受体在T细胞、NK细胞及单核细胞上结合，介导免疫抑制信号传递。这种跨细胞类型的通讯网络表明B7/CD28家族是TIME中多维免疫调控的核心枢纽。

图3 通过CellChat预测的B7/CD28家族蛋白在肿瘤细胞、内皮细胞及免疫细胞中的细胞间配体－受体相互作用

B7H3是肝癌预后的独立风险因素

单因素Cox回归分析显示，在14个B7家族成员中，仅B7H3（HR = 0.77, 95%CI=0.46~1.30, P = 0.222）与OS相关。Lasso回归进一步筛选，B7H3是唯一保留在预后模型中的特征基因。基于B7H3表达水平构建的风险评分将365例TCGA患者分为高风险组（n = 183）与低风险组（n = 182），Kaplan-Meier分析显示低风险组OS显著延长（P = 0.0222）。时间依赖性ROC曲线显示1年、3年、5年生存预测的AUC分别为0.631、0.571和0.549，证实B7H3具有中等预测效能。

图4 预后特征的建立

临床队列验证B7H3表达模式与预后关联

在94例HCC切除患者中，IHC检测显示B7H3在90%（85/94）的肿瘤组织中呈阳性表达，其中弥漫型HCC阳性率为90.5%（19/21），结节型为90.4%（66/73）。多色免疫荧光揭示B7H3存在三种定位模式：仅肿瘤细胞表达（Tc+，占57.5%）、仅基质表达（Strm+，占68%）及混合表达（占36%）。基质B7H3阳性定义为非恶性细胞（成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞等）的着色。

生存分析显示，总体B7H3阳性与否对OS（P = 0.1462）和PFS（P = 0.4724）无显著影响。然而，基质B7H3阳性患者OS显著缩短（P = 0.0324），而肿瘤细胞B7H3表达与OS（P = 0.2100）及PFS（P = 0.9555）均无关联。多因素Cox回归校正年龄、性别、HBV感染、肿瘤大小、血管侵犯等因素后，基质B7H3阳性仍是OS的独立危险因素（HR = 2.31, 95%CI= 1.18~4.52, P = 0.014）。

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图5 B7H3在肿瘤组织中的表达模式

B7H3表达与临床病理特征的关联

基质B7H3高表达与肿瘤直径>50 mm（P = 0.024）、卫星结节形成（P = 0.018）及高AFP水平（>300 ng/mL，P = 0.041）显著相关，而与年龄、性别、肝硬化、HBV感染无统计学差异。这表明基质B7H3表达与肿瘤侵袭性生物学行为密切相关。

结论

本研究通过多组学整合分析，系统阐明了B7/CD28家族在肝癌免疫微环境中的表达异质性及通讯网络，证实B7H3是预测HCC预后的关键分子。特别重要的是，基质而非肿瘤细胞B7H3表达是独立不良预后因素，这一发现突破了传统仅关注肿瘤细胞标志物的局限，强调了肿瘤间质在免疫逃逸中的核心作用。B7H3通过TREML2受体与多种免疫细胞互作，形成免疫抑制性微环境，促进肿瘤进展。因此，靶向B7H3的免疫治疗策略可能通过阻断基质-免疫细胞间通讯，恢复T细胞与NK细胞功能，为晚期HCC患者提供新的治疗选择。未来需开展多中心前瞻性研究，并探索抗B7H3联合PD-1/PD-L1阻断的协同效应，以推动临床转化。

参考文献

Cai Y, Liu X, He T, et al. Unveiling B7/CD28 family proteins in hepatocellular carcinoma: insights into communication and prognostic significance. Front Immunol. 2025;16:1583597. Published 2025 Jul 30. doi:10.3389/fimmu.2025.1583597

审批号：CN-174971
审批时间：2025-12-15
有效期至：2026-12-23
声明：本材料由阿斯利康提供支持，仅供医疗卫生专业人士参考。

责任编辑：肿瘤资讯-QTT
排版编辑：肿瘤资讯-李鑫