慢性髓性白血病（Chronic myelogenous leukemia,CML）是一种具有特征性费城染色体的骨髓增生性血液系统恶性肿瘤。随着单一肿瘤基因BCR-ABL的发现，以及酪氨酸蛋白激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼（Imatinib,IM）的临床应用，CML患者的治疗结局得到显著改善。然而，耐药性和停药问题仍是目前亟待解决的临床难题。伊马替尼耐药可分为BCR-ABL依赖型和BCR-ABL非依赖型。前者由BCR-ABL突变引起，大多数患者可选择新一代靶向药物进行治疗。但后者通常由异常激活的微小残留病（Minimal residual disease,MRD）引起，治疗较为困难。
造血微环境（Hematopoietic microenvironment,HM）可以维持和调节造血干/祖细胞和白血病细胞的增殖和分化。骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs）是HM的主要功能成分。骨髓基质细胞的间隙连接细胞间通讯（Gap junction incercellular communication,GJIC）参与造血细胞的调节和同步化。既往关于耐药性和MRD产生的研究主要强调BMSC粘附和分泌功能的变化。目前，许多证据表明HM中的GJIC也是影响白血病细胞增殖、凋亡和药物敏感性的重要因素。连接蛋白43（Connexin 43；简称Cx43）是人类中最常见和最广泛的连接蛋白，是一种在细胞表面和核膜中表达的主要结构蛋白。它与类似的分子对接并形成间隙连接。离子、小分子代谢产物、第二信使和微小核糖核酸（RNAs）可以在紧密相邻的细胞之间直接传递。我们前期研究发现，Cx43高表达的人脐带干细胞增强了化疗药物的效果，并且可以在动物模型中尽可能地消除残留的L615细胞。然而，目前对于Cx43在CML伊马替尼耐药中的功能和详细机制仍不清楚。
近期，陆军军医大学新桥医院的张曦教授作为通讯作者，李小平博士作为第一作者于Chinese Medical Journal杂志发表一篇题为“Connexin 43-modified bone marrow stromal cells reverse the imatinib resistance of K562 cells via Ca2+-dependent gap junction intercellular communication”的论文，该研究旨在探索BMSC中Cx43在IM处理下对K562细胞凋亡、增殖和细胞周期的影响。
研究方法
采用免疫组织化学方法比较CML患者和健康人骨髓活检组织中Cx43和缺氧诱导因子1α（HIF1α）的表达。在IM处理下，建立了K562细胞和几种Cx43修饰的BMSC的共培养体系。检测了不同组别中K562细胞的增殖、细胞周期、细胞凋亡等指标，以研究Cx43的功能及其可能机制。研究人员通过免疫印迹试验评估了Ca2+相关途径。还建立了荷瘤模型来验证Cx43在逆转IM耐药性中的因果作用。
研究结果
CML患者的骨髓（Bone Marrow，BM）中Cx43表达增高而HIF-1α表达减低
由于Cx43是构成GJIC的重要成分，研究人员通过免疫组化检测了10例初诊CML患者和10名健康供者骨髓活检标本中Cx43的表达。患者信息列于表1。
结果显示，CML患者Cx43的平均积分光密度值（IOD）在统计学上显著高于健康人（图1A）。在10例CML患者中，4例显示阴性表达（阴性定义：IOD<2000），而来自健康供者的所有BM标本均为阳性（图1B）。BM标本中Cx43的表达是异质性的。然而，在被诊断为CML的患者中，Cx43的表达有所下降。
缺氧常见于许多类型的慢性肿瘤。最近的研究表明，在一些血液系统恶性肿瘤中，BM中的生理性缺氧促进了造血干细胞（Hematopoietic stem cells，HSCs）和BMSC之间的通讯缺失。HIF-1α是与缺氧相关的关键转录因子。研究检测了健康供者和CML患者的活检标本中测量HIF-1α和Cx43水平（图1C），发现健康供者和CML患者中的HIF-1a水平和Cx43水平之间呈负相关。
表1. CML患者和健康供者骨髓活检组织中Cx43的IOD（平均值）
图1. 在CML患者的活检组织中发现Cx43减少，HIF-1α增加
缺氧与BMSC中Cx43的表达呈负相关
由于BMSC是BM的主要组成部分，用缺氧诱导试剂CoCl2（100 mmol/L）诱导BMSC生理性缺氧以防止HIF-1a的降解。从健康供者中分离BMSC，并通过流式细胞术进行鉴定（图1D）。研究人员发现在CoCl2处理的BMSC（BMSCs-CoCl2）中HIF-1α的表达增加，Cx43表达在转录和翻译水平上降低，而未经处理的BMSC则结果相反（图1E-1G）。
为了进一步验证HIF-1α是Cx43的调节因子，使用Ad-shHIF-1α-GFP减低BMSC中HIF-1α的表达。如图1H所示，发现在用Ad-NC-GFP转染的BMSC（BMSCs-NC）中，CoCl2处理导致HIF-1α表达增加，Cx43表达减少，但当HIF-1α被敲除时，Cx43表达恢复（图1H）。这一结果表明HIF-1α位于Cx43的上游，HIF-1α表达的逆转及逆转缺氧可使恢复BMSC中Cx43的表达。
BMSCs-overCx43具有最强的GJIC功能
为了在体外观察Cx43的作用，用Ad-overCx43-GFP、Ad-NC-GFP和Ad-shCx43-GFP转导P3-P5 BMSC，它们分别上调、不改变和下调Cx43在BMSC的表达。这三种BMSC被定义为BMSCs-overCx43、BMSCs-NC和BMSCs-shCx43。通过免疫印迹试验和RT-qPCR测量三种BMSC中Cx43的表达（图2A~2C）。
用gap-FRAP试验对三种Cx43修饰的BMSC的GJIC功能进行检测（图2D）。根据图2E和2F的数据，正常BMSC的荧光强度在300秒内恢复到22%,在500秒内恢复到30%,而BMSCs-over Cx43的荧光强度在300秒和500秒内可分别恢复到37%和48%, BMSC-shCx43的荧光强度仅分别恢复到13%和17%。在1000秒后，BMSCs-overCx43显示出最高的荧光恢复率，平均恢复率为59%，相比之下，BMSCs-NC则为43%，BMSC-shCx43仅为23%。此外，BMSCs-overCx43、BMSCs-NC和BMSC-shCx43分别需要大约105s、140s和759s才能达到20%的恢复。这些结果表明Cx43过表达的BMSC具有最强的GJIC功能。
图2. Cx43过表达的BMSC显示增强的GJIC功能
Cx43修饰的BMSC在IM处理下影响K562的凋亡和细胞周期，但不影响增殖
K562是从处于急变期的CML患者中分离的造血祖细胞系，是公认的具有代表性的CML细胞。IM能以时间和浓度依赖的方式杀死K562细胞。基于此，研究人员建立了Cx43修饰的BMSC和K562细胞直接接触的共培养系统，以探索Cx43对K562细胞存活状态的影响。随后，对五个组进行不同的处理：k562组（仅k562细胞）、IM组（用IM处理的k562细胞）、overCx43组（K562细胞与BMSCs-overCx43共培养并经IM处理）、NC组（K562细胞与BMSCs-NC共培养并经IM处理）和shCx43组（K562细胞与BMSCs-shCx43共培养并经IM处理）。
用CCK8试验来检测K562细胞增殖（图3A）。在72小时的共培养中，研究人员发现任何IM处理组在细胞增殖方面均没有统计学上的显著差异。流式检测K562细胞的细胞周期（图3B-3E），结果显示，与IM组相比，shCx43组中处于G0/G1期的比例在统计学上显著增加（图3B），而在overCx43组中观察到相反的结果（图3C）。关于细胞凋亡（图3F–3I），研究发现与IM组相比，NC组的细胞凋亡率较低，这证实了BM对白血病细胞的保护作用（图3F）。shCx43组的K562细胞凋亡率明显低于IM组甚至NC组（图3F和3H）。overCx43组的凋亡率与IM组疾病相当（图3G和3I）。综上所述，结果表明BM中Cx43的过表达对促进IM的杀伤效应起重要作用。
图3. IM处理后，Cx43过表达HM中的K562细胞显示出较高的凋亡率
Cx43通过细胞-细胞间接触影响IM的疗效
Cx43不仅参与GJIC，文献报道其还可通过隧道纳米管、细胞外囊泡甚至外分泌介导非相邻细胞间的通讯。为了探索该研究中Cx43到底通过GJIC还是其他非接触机制发挥作用，研究人员采用了transwell板（0.4 mm孔，6孔）来分离培养BMSC和K562细胞。结果显示，overCx43组、shCx43组、NC组，甚至IM组之间的凋亡率没有统计学差异（图4A），这表明细胞-细胞间接触在介导IM的杀伤中起主导作用。
共培养后，测定K562细胞和BMSC中Cx43的水平。研究人员发现，与BMSCs-overCx43共培养后的K562细胞，其Cx43在转录和翻译水平上都有所增加（图4B和4C），而Cx43在未经处理的K562细胞表面几乎不表达。有趣的是，研究还观察到共培养后的BMSCs-overCx43中Cx43的表达水平都高于共培养前（图4D和4E）。
对共培养前后的BMSC进行免疫荧光测定，研究人员发现共培养后BMSC中Cx43的信号更强（图4F）。此外，还观察到增加的Cx43主要在BMSC细胞膜和核膜中表达。该结果表明，虽然HM影响白血病细胞的生存状态，但白血病细胞也在同时改造着HM。
图4. 细胞-细胞接触在GJIC中起主导作用
通过Cx43通道的Ca2+转移介导了Cx43过表达的HM中IM的协同功效
GJIC允许包括Ca2+和ATP在内的小分子快速交换进入细胞质。为了探索ATP或Ca2+等小分子是否在CML细胞耐药中起因果作用，研究人员检测了细胞内ATP和Ca2+的浓度。在以下4个经IM处理的组（后3个）中发现ATP浓度无显著差异（图5A）。Ca2+浓度方面，overCx43组中的钙荧光强度比其余各组都高（图5B）。
为了验证Ca2+从BMSC转移至K562细胞并增强Cx43过表达HM的促凋亡功能这个假设，检测了Ca2+相关的凋亡指标。Ca2+与线粒体信号密切相关，线粒体介导的凋亡是由线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）的消失启动的。由于MMP去极化被认为是Ca2+触发的细胞凋亡早期事件，研究人员还比较了各组K562细胞的MMP去极化水平。与研究假设一致，overCx43组的MMP显著增加，而overCx43组和IM组之间没有发现差异（图5C和5D）。
线粒体是ROS的主要靶点，ROS累积可导致线粒体膜的损伤，甚至细胞死亡。通过流式细胞仪检测K562细胞的细胞内ROS水平，研究人员发现overCx43组的ROS水评显著增加（图5E）。
图5. Cx43修饰的BMSC通过Ca2+依赖途径影响IM的疗效
Ca2+通过caspase和CaMKⅡ-Akt-mTOR信号通路增强IM的杀伤效应
虽然Cx43的发现以及Ca2+转移诱导K562细胞凋亡已得到证实，但其分子机制仍不清楚。因此，研究人员通过免疫印迹试验研究了与Ca2+相关的经典和新的凋亡途径。当提到凋亡时，线粒体凋亡途径和caspase途径被认为是经典的和最常见的。如图5F所示，与BMSCs-NC共培养的K562细胞相比，可以观察到与BMSCs-overCx43共培养的K562细胞中BCL-2减少，BAX增加，细胞色素C（CytoC）表达增加。此外，裂解的caspase-9、裂解的caspase-3和裂解的PARP的表达水平明显高于NC组和K562组。
CaMKⅡ是Ca2+信号的“总集成器”，调节许多类型细胞的发育和活性。 CaMKⅡ与细胞生长相关的途径紧密相连。研究人员通过免疫印迹试验评估了从四个组（IM组、NC组、overCx43组和K562组）分离的K562细胞中的CaMKⅡ-Akt-mTOR途径，结果显示，与NC组相比，overCx43组中的p-CaMKⅡ增加，p-Akt减少，p-mTOR表达减少（图5G）。这表明CaMKⅡ-Akt-mTOR途径也参与了Ca2+介导的GJIC途径。
随后，研究人员还测量了K562细胞中BCR-ABL及其下游分子p-CrkL的表达，以检验Cx43是否可以直接调节BCR-ABL通路（图5H）。然而，Cx43组与正常对照组之间无明显差异。
Cx43修饰的BMSC抑制K562细胞的致瘤性
建立裸鼠荷瘤模型以评价Cx43在体内实验中是否对IM杀伤K562细胞起协同作用。将小鼠随机分为三组（n=4）。将总共8×106 K562细胞加2×106 BMSCs-overCx43 (Cx43组)、8×106 K562细胞加BMSCs-NC(对照组)、以及1×107 K562细胞（K562组）分别注射到每组小鼠的右腹部皮下组织中。从第6天开始，每间隔两天向Cx43组和对照组予以200 mL的IM稀释液灌胃，而向K562组给予200mL水。每三天测量一次肿瘤体积，直到荷瘤后第24天。研究人员观察到，与对照组相比，Cx43组小鼠的肿瘤体积始终较小，生长速度较慢（图6A）。此外，对照组小鼠脾脏比Cx43组相对更大。K562组的小鼠表现的肿瘤体积和脾脏最大（图6B）。三组的平均体重没有显著差异（图6C）。
随后，研究人员还进行了免疫组织化学染色。从HE染色结果来看，在显微镜下发现Cx43组瘤荷组织中有大量的肿瘤细胞，远大于其他两组。此外，在Cx43组切片中观察到炎症浸润（图6D）。Cx43表达水平在Cx43组的肿瘤组织中呈强阳性，而在K562组中几乎不显色。研究者对其他增殖性指标（Ki67、BCL-2和BCR-ABL）和凋亡性指标（BAX和TUNEL）也进行了染色，结果显示与对照组相比，Cx43组中Ki67和BCL-2水平降低，BAX和TUNEL水平升高，这表明Cx43过表达的HM可以抑制肿瘤生长，并与IM协同发挥杀肿瘤作用。研究人员还发现Cx43通过Ca2+介导的途径影响IM对K562细胞的杀伤作用，并进一步探讨了其可能的机制。总之，本研究结果可为逆转IM耐药性提供新的思路。
图6. BMSC过表达Cx43促进IM处理下K562细胞凋亡
讨论
伊马替尼耐药是CML治疗的主要障碍。BM对白血病细胞的保护作用是白血病发生和复发的重要因素，并促进了MRD和耐药性的发展。
BM是白血病细胞躲避化疗的天然庇护所。据报道，BMSC通过CXCR4 / CXCL12轴保护CML细胞免受伊马替尼诱导的凋亡。在这项研究中，研究人员观察到CML微环境中Cx43的表达降低，提高Cx43的水平是逆转耐药性和促进IM作用的新策略。
缺氧状态在许多慢性肿瘤中较为常见。据报道，缺氧可诱导H9c2心肌细胞中Cx43的失调。在大鼠模型中，缺氧会导致BMSC中细胞凋亡和Cx43表达降低。由于HM是造血细胞和白血病细胞的养料，研究人员检测了正常BMSC中Cx43和HIF-1α的表达，发现Cx43和HIF-1α之间呈负相关。逆转缺氧状态可能是增加患者骨髓微环境中Cx43的表达并进一步提高化疗效果的好方法。
Cx43因其抗肿瘤功能，在多种肿瘤中被认为是一种肿瘤抑制因子。以往关于白血病中MRD形成和耐药性的研究主要集中在白血病细胞周围的邻近细胞和分泌细胞因子。此外，一些研究报道，从间充质基质细胞分泌的外泌体也可以介导抗白血病过程。本研究以K562细胞为研究对象，通过transwell试验证明了Cx43介导的凋亡是间隙连接依赖性的，并发现Cx43缺失使K562细胞的周期阻滞在G0/G1期，这有利于逃避化疗。动物实验表明，荷瘤K562细胞联合BMSCs-overCx43的裸鼠在IM治疗后肿瘤体积最小，这表明骨髓微环境中Cx43的增加有助于增强IM的杀伤效果并延缓体内疾病的进展。有趣的是，研究人员还观察到K562细胞和BMSC中Cx43的表达是相互的：BMSC中Cx43的过表达可以促进K562细胞中Cx43的表达，反之亦然。这一观察具有启发性，值得进一步探讨。
据报道，间隙连接可以促进小分子或代谢物的直接胞质递送，并且Cx43可以调节Ca2+进入和ATP释放。ATP和Ca2+均可从Cx43通道释放并影响细胞功能。Ca2+被认为是促凋亡信号分子。在目前的研究中，研究人员发现在与BMSCs-overCx43共培养的K562细胞中Ca2+荧光强度增加，而在三个IM处理组中没有检测到ATP浓度的差异，这表明Ca2+而非ATP通过GJIC在K562细胞的调节中起重要作用。 CaMKⅡ是Ca2+信号的整合者，Ca2+信号在多个系统和细胞类型中普遍表达。据报道，CaMKⅡ的过表达导致Ca2+水平紊乱，并促进心肌细胞的凋亡。Liu等人证明了Ca2+-CaMKⅡ信号以及ROS可以介导Akt/mTOR通路的抑制，并最终导致神经细胞凋亡。下游mTOR信号参与了肿瘤细胞的许多代谢过程，其活化形成被认为是细胞增殖的信号。而在这项研究中，除了经典的线粒体诱导的凋亡途径，新的线粒体非依赖性CaMKⅡ-Akt-mTOR也被评估和建立（图7）。
图7. BMS cs-over Cx43逆转耐药性和促进IM疗效的机制
这项研究仍有一些局限性。本研究没有阻断K562细胞中的核心分子Ca2+,因为Ca2+对细胞存活非常重要，研究人员用螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）螯合Ca2+，但这一举动会导致K562细胞和BMSC的死亡。这项研究也提供了一些新的思路。由于Cx43过表达的BMSC确实提高了IM的杀伤效果，并在一定程度上抑制了耐药性，因此可以在化疗耐药性产生之前，甚至在移植之前，重点为白血病患者修复HM中的GJIC功能。
BM修复GJIC功能有两种方法。全反式维甲酸（ATRA）已被用于治疗急性早幼粒细胞白血病（APL）和其他基于诱导分化和抑制生长的血液系统疾病。也有报道称，ATRA治疗可以在mRNA和蛋白水平上增加白血病BMSC中Cx43的表达，并促进细胞间通讯。此外，HSCT后共移植人脐带间充质干细胞是修复GJIC功能、消除MRD、抑制复发和耐药性的另一种方式，因为脐带间充质细胞输注已广泛用于临床实验，具有多种优势。
研究结论
总之，这项研究证明缺氧诱导的Cx43下调在CML 骨髓微环境中很常见，并能促进耐药。BMSC中Cx43过表达削弱了BMSC对肿瘤细胞的保护作用，并通过Ca2+依赖的GJIC增强了IM诱导的凋亡。
Xiaoping Li, Yunshuo Xiao , Xiaoqi Wang, et al; Connexin 43-modified bone marrow stromal cells reverse the imatinib resistance of K562 cells via Ca2+-dependent gap junction intercellular communication;Chinese Medical Journal 2023;DOI: 10.1097/CM9.0000000000002554.
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