Lisaftoclax（APG-2575）是一种新型BCL-2抑制剂，通过选择性抑制Bcl-2蛋白来恢复肿瘤细胞程序性死亡机制（细胞凋亡），从而诱导肿瘤细胞凋亡，达到治疗肿瘤的目的。Lisaftoclax是首个在中国进入临床阶段的、本土研发的Bcl-2选择性抑制剂，目前已在美国、中国、澳大利亚、欧洲等全球多地开展包括CLL/SLL在内的多种血液肿瘤和实体瘤的临床研究。近期，Jing Deng教授等人在CLINICAL CANCER RESEARCH杂志中发表相关研究，描述了在一系列血液系统恶性肿瘤中Lisaftoclax的临床前特征，并重点关注这种新型BCL-2抑制剂有希望的抗肿瘤活性和潜在的作用机制。
目前已研发出多种靶向Bcl-2的小分子抑制剂
AT101是第一个被发现能抑制Bcl-2、B-celllymphoma-XL(Bcl-XL)和Myeloidcellleukemia-1（Mcl-1）的化合物，能与BH3模拟物结合，在多种肿瘤中发挥抗癌作用。
Oblimersen是由18个碱基组成的与Bcl-2mRNA互补的单链DNA分子，可通过抑制Bcl-2mRNA，从而抑制Bcl-2家族蛋白的表达，目前已被证实对黑素瘤有效。
Navitoclax（ABT-263）是基于Oblimersen开发的第二代口服产品，与Oblimersen具有相似的生物学特征。临床前研究表明，Navitoclax能够抑制Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-w蛋白的活性，从而抑制多种肿瘤细胞的增殖，但由于Navitoclax对Mcl-1蛋白的亲和力和抑制作用均较差，在某些实体瘤或白血病患者的细胞中Mcl-1蛋白高表达时，容易造成对Navitoclax的耐药。
Venetoclax（ABT-199，维奈克拉）相较于Navitoclax，其产生的血小板减少等不良反应得到很大程度的改善，其对Bcl-2蛋白的亲和力更强，对Bcl-XL的亲和力较弱。然而，许多接受维奈克拉的患者报告了血液学毒性和肿瘤溶解综合征(TLS)。
在此，研究者报告了Lisaftoclax，作为一种新型、有效的口服BCL-2特异性抑制剂，在血液系统恶性肿瘤中的抗肿瘤活性和潜在的作用机制。
Lisaftoclax是一种新型BCL-2选择性抑制剂
Lisaftoclax和维奈克拉（作为对照组）之间存在两个关键的结构差异，在位点1，二甲基基团被环丁基环取代，在位点2，四氢-2H-吡喃基团被1,4-二恶烷取代。构效关系研究证实对位点1和2进行修饰是可行的，这使得Lisaftoclax仍然对BCL-2具有有效的结合亲和力，在BCL-2依赖性细胞系中表现出细胞活性，并且在动物中表现出可接受的药代动力学（PK）特征。在竞争性FP配体结合试验中，与维奈克拉相比，Lisaftoclax与BCL-2、BCL-xL和MCL-1的结合特征非常相似，对BCL-2的Ki<0.1 nM，与BCL-xL以及MCL-1结合的亲和力均较弱。
在BCL-2依赖性细胞系RS4;11、HL-60和MV-4-11中检测了Lisaftoclax的体外细胞活力活性。Lisaftoclax在这些细胞中的IC50值为3.6nM(RS4;11)、2.4nM(HL-60) 和1.9 nM（MV4；11；均与维奈克拉相当或低于维奈克拉）。尽管Lisaftoclax与BCL-xL具有纳摩尔级的结合亲和力，但它对SKLU-1细胞系的细胞存活率的影响很小，SKLU-1依赖于BCL-xL-抗凋亡蛋白生存，正如细胞系对BCL-xL-特异性抑制剂WEHI-539和BCL-2/BCL-xL抑制剂ABT-263的敏感性所示（图1）。此外，Lisaftoclax对MCL-1依赖性NCI-H23细胞的活力也没有影响，细胞存活率被MCL-1抑制剂A1210477抑制。
图1
CLL患者来源的原代样本对Lisaftoclax更敏感（与维奈克拉相比），暴露于每种BCL-2抑制剂4小时后，Lisaftoclax的IC50值降低了2倍（P=0.05）。其他的CLL样本也显示了Lisaftoclax对细胞活力更强效的抑制（与维奈克拉相比，P=0.0022）。在细胞增殖试验中，MM细胞系中的Lisaftoclax中位IC50为3.6µM（维奈克拉为4.4µM），WM细胞系中的Lisaftoclax中位IC50也较低（3.0 vs. 7.0µM；P=0.0027）。在原代人MM细胞中，与维奈克拉（3.01µM；P=0.0030）相比， lisaftoclax的中位IC50也低了近2倍（1.33µM）（图2）。
图2
Lisaftoclax以时间和剂量依赖性方式破坏BCL-2复合物，是一种BH3模拟物
为了阐明Lisaftoclax的作用机制，研究者采用了一种先进的电化学发光测定法(ECLA)。当用Lisaftoclax或维奈克拉处理时，RS4;11（ALL）和Toledo(DLBCL)细胞系，显示细胞裂解物中BCL-2:BIM（而不是BCL-xL：BIM）复合物减少（图3）。利用SUDHL-4（另一种DLBCL细胞系）或Toledo细胞进行的免疫共沉淀(Co-IP)试验证实了Lisaftoclax和维奈克拉对BCL-2:BIM复合物的剂量依赖性和选择性破坏。
随后，研究者使用ECLA探索了Lisaftoclax破坏MM和WM模型中BCL-2:BIM复合物形成的能力，与RS4;11和Toledo细胞中的研究结果相似，可以观察到KMS-11和BCWM中BCL-2:BIM复合物的快速和时间依赖性破坏。然后通过直接线粒体暴露，使用人类BCL-2(O-BCL-2)、BCL-xL(O-BCL-xL)、MCL-1(O-MCL-1)或BFL-1/A1(O-BFL-1/A1)增强表达的4种细胞系，以及BAX和BAK纯合子缺失的另外一种细胞系（O-双敲除[DKO]），对Lisaftoclax进行了进一步评估。Lisaftoclax诱导 O-BCL-2线粒体释放细胞色素c的浓度比O-BCL-xL线粒体低2个数量级。但Lisaftoclax对O-MCL-1或O-BFL-1/A1线粒体的细胞色素c释放没有影响，也不会触发O-DKO（BAX/BAK双敲除）线粒体的细胞色素c释放。细胞毒性试验证明，Lisaftoclax具有更大的杀伤O-BCL-2细胞的活性（与O-BCL-xL、O-MCL-1和O-BFL1相比），但在O-DKO和其他细胞中这种活性被消除（图4）。
图3
图4
Lisaftoclax在MM和WM模型中对其凋亡诱导活性更有效
在RPMI 8226(MM)细胞中，细胞摄取试验显示，Lisaftoclax能迅速进入肿瘤细胞，细胞内浓度在2小时达到平台期，并持续长达6小时。且与维奈克拉相比，Lisaftoclax进入RPMI 8226细胞的速度更快，在每个时间点达到的细胞内浓度高了1.44~1.61倍 (P<0.0500)。此外，在KMS-11(MM)细胞也观察到类似的结果，细胞内Lisaftoclax浓度高了1.46～1.92倍（与维奈克拉相比，P<0.0500）。
免疫印迹分析显示，在MM(P=0.0022)和WM细胞系（P=0.00230）中，与维奈克拉相比，Lisaftoclax触发的细胞色素c释放到细胞质中的能力更强。而且，在MM(72.92%vs 37.04%；P=0.0022)和WM(60.20%vs 50.00%；P=0.0411) 细胞系中，Lisaftoclax诱导的中位细胞凋亡比例也显著更高。
接下来，研究者在MM或WM患者来源的原代肿瘤细胞中进行了进一步表征。线粒体外膜通透性化(MOMP)是启动细胞凋亡的关键生物标志物，在暴露于Lisaftoclax的细胞中显著增加，表现为线粒体去极化的减少。在MM(61.68%vs 53.28%；P=0.0015)或WM（73.84%vs 58.00%；P=0.0043）中，与维奈克拉相比，Lisaftoclax治疗导致的细胞凋亡增加。
利用BCL-2家族蛋白的Western blot分析发现，Lisaftoclax可迅速提高促凋亡蛋白BIM和Noxa的水平（图5，左）。作为衡量BIM在启动细胞凋亡中作用的指标，暴露于Lisaftoclax后，观察到KMS-11细胞线粒体中积累了更多的BIM（与溶剂或维奈克拉相比；图5，右）。
为了了解Lisaftoclax触发线粒体凋亡信号级联的能力，研究者通过测量氧消耗率评估其对线粒体生物能量学的潜在影响。当用线粒体解偶联剂羰基氰化物-4-苯腙(FCCP)处理细胞时达到的最大呼吸，并在KMS-11细胞中显著降低（与维奈克拉相比，P=0.0027；与溶剂相比，P=0.0023）。与溶剂相比，非线粒体呼吸(P=0.0035)和备用呼吸能力(P=0.0150)也显著降低。这些变化导致Lisaftoclax治疗后细胞内线粒体ATP产生显著减少（与溶剂相比，P=0.0035），证实了Lisaftoclax在启动细胞凋亡时诱导其他线粒体功能损伤的能力。
图5
Lisaftoclax抑制血液系统肿瘤的体内生长，并增加细胞系来源的异种移植和PDX模型的存活率
在BCL-2依赖的RS4;11异种移植的ALL鼠模型中，到第15天每日一次经口给予Lisaftoclax 6.25 mg/kg后注意到肿瘤生长抑制(T/C 60%)，100 mg/kg剂量时达到峰值(T/C 4%)，体重无明显变化。DLBCL的Toledo异种移植模型进一步证实，肿瘤生长抑制与Lisaftoclax剂量成正比，100 mg/kg时抑制最大。
使用100 mg/kg剂量，研究者接下来研究了Lisaftoclax在MM异种移植模型(KMS-11)中的影响。通过Luc-标记肿瘤细胞的生物发光信号强度（总通量；与溶剂相比P=0.0010）测定，到第20天，Lisaftoclax治疗组的肿瘤负荷显著降低，尽管Lisaftoclax和维奈克拉治疗小鼠之间没有统计学差异。Lisaftoclax耐受性良好，小鼠体重无明显下降。Kaplan-Meier分析证明接受Lisaftoclax治疗的小鼠生存期显著延长（中位生存期，25天 vs 溶剂对照组21天；P<0.05）。
在WM异种移植模型（BCWM.1）中，在第15天进行Lisaftoclax快速治疗治疗后，T/C比值为25.12%（无明显毒性或体重减轻）。与溶剂对照组（21天；P=0.0190）相比，接受Lisaftoclax（29天）的小鼠的中位生存期更长。在肿瘤组织中观察到cleaved caspase-3的IHC染色强度增加（与溶媒相比，P=0.0025），证实了BCWM中细胞凋亡增强。
除了人类癌细胞系来源的异种移植，研究者还从BTK抑制剂伊布替尼耐药WM患者建立了PDX模型。研究结果显示，与维尼克拉（P=0.0002）或伊布替尼（P=0.0003）相比，Lisaftoclax暴露的小鼠肿瘤负荷（T/C 17.56%）显著降低。
RS4;11异种移植模型中Lisaftoclax的药效学(PD)和药代动力学(PK)
在RS4;11异种移植模型中，小鼠在采集肿瘤样本进行PD分析前接受单次经口给予 Lisaftoclax或维奈克拉 6.25 mg/kg。清除的caspase-3在4h后被迅速诱导，并在Lisaftoclax处理24h达到峰值。cleaved caspase-3的增加伴随着多聚ADP核糖聚合酶 1(PARP-1)裂解的诱导，表明Lisaftoclax或维奈克拉引发的凋亡诱导活性相当（图6A）。
在RS4;11荷瘤小鼠的相似模型中进行了PK分析，这些小鼠接受了单次经口给药的6.25 mg/kg、25 mg/kg或 100 mg/kg Lisaftoclax和 25 mg/kg 维奈克拉作为对照。
在血浆和肿瘤中均观察到Lisaftoclax的剂量依赖性增加。给予100 mg/kg Lisaftoclax的小鼠血浆Cmax为7,803.3 ng/mL，AUC0-last为123,401.2 h•ng/mL。Lisaftoclax和维奈克拉 25 mg/kg在血浆中显示相似的消除半衰期 (t1/2) 值：分别为5.2~6.0和6.3小时。在肿瘤中，3种Lisaftoclax剂量的t1/2为13.2～48.1小时，而25 mg/kg 维奈克拉的t1/2为18.1小时（图6B ）。
图6
Lisaftoclax对血液学和造血功能的影响
为评价Lisaftoclax对功能性造血的影响，从正常近交系BALB/c(H2d)雌性小鼠中采集骨髓样本，并接种至96孔板中，用DMSO（溶剂对照）和浓度递增的Lisaftoclax和维奈克拉进行处理。在处理24和72小时后，活力分析显示，Lisaftoclax的IC50值分别约为20μm和10μm。基于IC50值，细胞在48小时和72小时时间点对Lisaftoclax和维奈克拉的敏感性相似。
在雄性和雌性CD-1小鼠中进行进一步评估，这些小鼠每日经口给予100、300和1，000 mg/kg的Lisaftoclax，持续28天。仅在接受1,000 mg/kg/天给药的小鼠中观察到与利沙妥昔单抗相关的轻度至中度血液学效应，在接受100或 300 mg/kg/天给药组中观察到的结果较少。
与血液学检查结果相似，在1,000 mg/kg/天给药组雄性小鼠的骨髓涂片中仅观察到少数可能与Lisaftoclax相关的轻微血液学效应，包括总红系计数轻度升高（由晚幼粒细胞计数升高所致）和淋巴细胞计数轻度降低。
讨论
基于构效关系研究，研究发现了一种新的BCL-2抑制剂Lisaftoclax，对BCL-2蛋白具有高结合亲和力和选择性。与真正的BH3类似物的作用机制一致，研究者使用BH3分析和细胞死亡试验证实了Lisaftoclax以 BAX/BAK依赖性方式触发BCL-2依赖性细胞系中细胞色素c的释放和凋亡。
敲除BAX和BAK可完全阻断用Lisaftoclax处理的肿瘤细胞中细胞色素c的释放和凋亡。这种作用方式与BCL-2:BIM复合物的破坏一致。一旦从BCL-2中释放出来，BIM可触发BAX/BAK活化增加MOMP，在1～6小时内导致细胞凋亡。使用癌细胞系和小鼠异种移植模型进行的样本分析表明，Lisaftoclax对BCL-2:BIM复合物的靶向结合是其抗增殖和总体抗肿瘤活性的基础。一系列B细胞淋巴样癌对Lisaftoclax敏感，但在所检测的一组癌细胞中存在一些变异（正如预期），其中CLL和某些类型的DLBCL(OCI-LY1)、ALL(RS4；11)、FL(DOHH2)和AML(MOLM-13)细胞最为敏感。
尽管Lisaftoclax和维奈克拉具有相似的作用机制，但其抗BCL-2作用的程度可能不同。在MM和WM细胞系和患者来源的原代样本中，Lisaftoclax治疗导致更强的半胱天冬酶3/7活化和更大程度的凋亡诱导活性。Lisaftoclax的这些特征可能归因于：与维奈克拉相比，1）更快速的细胞摄取，在MM细胞中的蓄积更高；2）更强效地破坏BCL-2:BIM复合物；3）更强地诱导促死亡BH3蛋白BIM及其从细胞质转位至线粒体；和/或4）含BH3的原生蛋白Noxa水平升高更明显。Lisaftoclax治疗可显著抑制WM肿瘤生长，导致模型中的生存期显著延长。相比之下，维奈克拉的抗肿瘤活性极小。这种差异的生物学机制目前正在研究中。
虽然在RS4;11异种移植模型中证明了Lisaftoclax的单药活性，但联合治疗在DLBCL异种移植模型(OCI-LY8)中显示了更明显的肿瘤生长抑制。与单药或双联药物相比，当与利妥昔单抗或利妥昔单抗和苯达莫司汀联合使用时，Lisaftoclax表现出更长的持续时间和更深的缓解（即CR），表明Lisaftoclax与标准治疗联合治疗可能对某些类型的肿瘤更有效，例如对BCL-2以外的致癌或抗凋亡蛋白具有异质性依赖性的淋巴瘤。
Lisaftoclax的关键作用机制是破坏BCL-2复合物，拮抗其抗死亡功能恢复癌细胞凋亡。细胞凋亡的启动需要BAX/BAK的激活与孔形成的寡聚化，导致MOMP。
除了BCL-2蛋白家族的典型途径外，研究还发现，在MM细胞中，Lisaftoclax治疗降低了线粒体和非线粒体呼吸能力，并降低了线粒体ATP的产生。此外，在MM和/或WM细胞中，与维奈克拉相比，Lisaftoclax诱导线粒体功能降低更明显。这些发现提示，Lisaftoclax引起的线粒体损伤引发了更广泛的细胞应激反应。
体外和体内正常小鼠血液学和造血的初步毒性评估表明，正常骨髓对Lisaftoclax耐受良好。Lisaftoclax治疗后外周血和骨髓样本中淋巴细胞计数较低可能与BCL-2抑制剂的药理学有关，BCL-2抑制剂会抑制B细胞和T细胞亚群。
总结
总体而言，本研究发现了一种真正的BH3模拟物、BCL-2选择性抑制剂，在几种血液恶性肿瘤（包括CLL、ALL、DLBCL、MM和WM）的临床前模型中具有潜在的生物学和治疗意义。此外，在基于接受伊布替尼治疗后复发的侵袭性WM患者而建立的PDX模型中，Lisaftoclax治疗克服了BTK抑制剂的耐药性并抑制了肿瘤生长。研究结果还表明，在基于细胞和异种移植模型中，Lisaftoclax触发线粒体介导的BAX/BAK依赖性凋亡，对线粒体功能具有广泛影响。
尽管已经证明在MM、WM和CLL模型中，Lisaftoclax具有更强的细胞凋亡诱导和抗肿瘤活性和抗肿瘤活性（与维奈克拉相比），但在其他模型（如AML）中，这些BCL-2选择性抑制剂的活性相当。因此，需要依据肿瘤类型或疾病异质性进行更多的研究来进一步评估Lisaftoclax的作用。目前已经启动了多项Ⅰb期和Ⅱ期临床试验，以评估Lisaftoclax作为单药治疗或与抗CD20抗体或BTK抑制剂联合治疗血液系统恶性肿瘤的疗效和安全性 (NCT03537482；NCT04260217)。
Jing Deng, Aneel Paulus, Douglas D. Fang, et al; Lisaftoclax (APG-2575) is a Novel BCL-2 Inhibitor with Robust Antitumor Activity in Preclinical Models of Hematologic Malignancy; CLINICAL CANCER RESEARCH.2022 Sep 1;CCR-21-4037. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-21-4037
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