弥漫性大B细胞淋巴瘤 (DLBCL) 是淋巴瘤中最常见的亚型，占所有成熟非霍奇金淋巴瘤的25%。这是一种高度异质性疾病，患者之间具有明显的生物学、病理学和临床变异性。近20年来，R-CHOP是大多数既往未经治疗的DLBCL患者的标准治疗。然而，仍然有高达40%的患者出现疾病难治或完全缓解 (CR) 后复发。而这部分人群的预后则较差，即使随后接受挽救性化疗和巩固性自体干细胞移植 (ASCT) ，其中仍有80%的患者最终将死于淋巴瘤。值得注意的是，R-CHOP的致死性毒性在年轻患者中并不常见，但在高风险类别中高达8%的患者可发生，而高风险在很大程度上受到年龄、功能状态和合并症的影响。相比之下，R-CHOP耐药则更为常见，预示着DLBCL预后不良。目前的策略已通过增加剂量密度或强度或在R-CHOP基础上加用新疗法，以提高R-CHOP疗效做出了大量努力。然而，这类策略在延长总生存期 (OS) 方面通常未能提供显著获益。因此，了解DLBCL治疗耐药的机制，改善现有的临床治疗，开发新的有效的治疗策略并最终达到最佳的患者结局，是未满足的迫切需求。在此，本综述了肿瘤异质性、肿瘤微环境 (TME) 和宿主变异性在DLBCL治疗耐药中的广泛作用。然后，研究者对用于DLBCL的治疗方法的耐药分子机制进行了最新讨论。最后，特别考虑了预防和克服DLBCL治疗耐药的潜在策略。
2021年国际著名期刊Leukemia公布该综述并收入癌症治疗耐药机制这一专栏并深受读者喜欢与关注。【肿瘤资讯】特别邀请江苏省人民医院范磊教授到为我们解读弥漫性大B细胞淋巴瘤的治疗耐药机制，并结合自身临床经验进行分享，详情如下。
中国抗癌协会第一届青年常务理事
中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会第一届青委副主委
中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会委员
江苏省医学会血液分会青委副主委
美国纽约哥伦比亚和康奈尔大学附属纽约长老会医院博士后
DLBCL治疗耐药的来源
在DLBCL中，由于治疗耐药而发生疾病复发或难治(rr)是很常见的，并且鉴于没有一种治疗被证明是普遍治愈的，因此对所有现有治疗，最终都有可能产生耐药。通常，固有性治疗耐药需与获得性治疗耐药区分开来，尽管这些现象可能同时存在。具体而言，固有性耐药来自于导致治疗无效的既存改变，而获得性耐药涉及在治疗期间通过突变或非突变方式获得导致疾病复发的耐药特征。在DLBCL中，治疗耐药通常起源于共同形成癌症生态系统的各种来源，包括异质性癌细胞本身、其周围微环境（即TME）及其宿主（即患者）。
肿瘤异质性
可在不同患者（患者间）样本之间和个体患者（患者内）样本内识别肿瘤异质性。它是治疗耐药最明显的原因之一，因为癌细胞的空间和时间遗传和/或表观遗传多样性往往与癌症治疗耐药有关。DLBCL表现出高度的患者间和患者内异质性。值得注意的是，这种患者间异质性可通过复杂的DLBCL分类系统反映出来。基因表达谱 (GEP) 的早期研究将80~85%的治疗前DLBCL分为两个起源细胞 (COO) 亚组，即生发中心B细胞样 (GCB) 和活化B细胞样 (ABC)，其余病例属于“未分类”。 这两个主要亚组之间R-CHOP治疗后的临床结局不同，其中ABC-DLBCL通常显示有较差的预后和较高的治疗耐药发生率。与COO分类平行，还对DLBCL亚型进行了病理学定义。例如，以MYC和B细胞淋巴瘤2(BCL-2)过度表达为特征的双表达淋巴瘤(DEL)约占新发疾病的1%，占rrDLBCL的50%。一项荟萃分析研究MYC和/或BCL-2过表达与DLBCL治疗耐药之间的关系，结果表明，MYC和/或BCL-2过表达与R-CHOP治疗DLBCL患者OS较差相关。此外，双重打击淋巴瘤 (double hit lymphoma，DHL) 是指携带MYC和另一种癌基因（通常为BCL2，较少为BCL6）基因重排的B细胞淋巴瘤。 MYC、BCL2和BCL6重排已被归类为三重打击淋巴瘤 (THL)。DHL/THL患者约占DLBCL患者的8%，大多数研究表明，标准R-CHOP方案在这些患者中疗效不充分。
二代测序技术的出现揭示了患者间体细胞突变谱的高度变异性。这些进展使包含新诊断患者样本的大型队列的整合基因组分析成为可能，开始了DLBCL遗传分类的新模式。例如，先前确定的GCB和ABC以及未分类的亚组已进一步定义为几种基因亚型：MCD/C5（以MYD88L265P和CD79B突变为特征）、BN2/C1（NOTCH2突变或BCL6易位）、N1（NOTCH1突变）、EZB/C3（EZH2突变或BCL2易位）、ST2/C4（SGK1和TET2突变）和A53/C2（TP53突变和缺失）。这些新的基因亚型表现出具有不同基因表达谱的不同肿瘤表型，并对患者生存结局产生不同的影响。例如，与BN2/C1和EZB/C3相比， MCD/C5和N1亚型免疫化疗后的结局较差。值得注意的是，在EZB亚型中，使用与不良结局相关的双重打击基因表达谱可以确定进一步的异质性。
除了这些分类学工作，最近的研究揭示了R-CHOP治疗后rrDLBCL的患者间和患者内遗传异质性。包括比较 (1)rrDLBCL患者与长期缓解患者的治疗前样本（定义预测疾病进展的生物标志物）；(2)rrDLBCL样本与未经选择的治疗前样本（了解rrDLBCL的发病机制）；和 (3)rrDLBCL样本与配对治疗前样本（以确定可作为治疗靶向的克隆扩增）。这些研究揭示了几个基因，其突变可能与疾病进展和/或对R-CHOP耐药有关。例如，已知肿瘤抑制基因TP53的改变可调节一般癌症治疗的反应，也发现与rrDLBCL相关。研究显示，与治疗应答样本以及未选择的治疗前样本相比，rrDLBCL样本中TP53突变更普遍，表明 TP53 突变与R-CHOP耐药相关。此外，匹配的rrDLBCL和治疗前样本的成对分析证实，与治疗前样本相比，TP53突变在复发时更常见。上述结果表明TP53突变在DLBCL克隆演变中起作用：在异质性癌细胞群中，携带和/或获得该突变标记的原有克隆可在R-CHOP治疗中存活，这也符合达尔文的进化论。与rrDLBCL相关的其他改变包括参与免疫监视（B2M、CD58、HLA-A和MS4A1）、表观遗传调控（EZH2、CREBBP、MEF2B、KMT2C和KMT2D）、细胞周期调控（CCND3、CDKN2A和CDKN2B）、信号通路活化（STAT6、SOCS1、FOXO1、MYD88、CD79B、NFKBIE、和NFKBIZ），以及癌基因（MYC、PIM1、PRKCQ、GATA3、MLLT10和ABl1）。对于免疫逃逸，重要的是要意识到基因改变不是唯一的原因，例如，已证明替代机制（如亚细胞定位变化）可导致60%以上的DLBCL病例中人白细胞抗原 I 和 CD58缺失，从而导致频繁逃避免疫识别。这些机制如何导致rrDLBCL患者的治疗耐药以及与基因失活的相互作用，将需要进一步研究来证实。
虽然基因改变代表了DLBCL治疗耐药的共同机制，但非突变修饰也是癌细胞会利用的逃避癌症治疗的途径，例如，通过选择或获得表观遗传学改变，如DNA甲基化和组蛋白修饰。Chambwe等人通过评估140例初发DLBCL与10例正常生发中心B细胞样本，确定了DNA甲基化破坏是主要的表观遗传事件。重要的是，同一研究根据DNA甲基化变异的程度进一步定义了6个DLBCL表观遗传簇，在接受R-CHOP治疗的患者中，DNA甲基化变异被证明与OS和无进展生存期(PFS)相关。同样，Pan等人检测了13例匹配的治疗前——复发DLBCL样本的全基因组DNA甲基化状态，确定了CpG岛甲基化增加和复发相关的甲基化标记，其特征是转化生长因子-β (TGF-β) 信号和抗凋亡通路的富集。研究者从一个独立的验证队列中进一步证明，肿瘤内甲基化异质性增加与复发相关，表明了表观基因组异质性在rrDLBCL中的潜在作用。
肿瘤微环境
癌细胞通常被TME包围，TME涉及不同组成的免疫细胞、基质细胞、血管和细胞外基质。这些肿瘤支持细胞与癌细胞之间的相互作用以及TME内分泌的可溶性因子已被证明对于介导各种癌症类型的治疗耐药发挥重要作用。在DLBCL中，恶性B细胞消除了正常淋巴组织结构，因此TME相对稀疏。然而，最近的研究直接表明，TME可导致DLBCL的治疗耐药。例如，共培养实验表明，DLBCL细胞系与基质细胞的粘附促进了细胞毒药物处理后的存活。 从机制上讲，这种细胞粘附介导的耐药性涉及通过癌细胞分子改变抑制细胞凋亡，例如激活NF-κB信号（粘附于骨髓基质细胞 (BMSCs)）和诱导microRNA-181a或减少microRNA-548m（粘附于滤泡树突状细胞）。此外，直接接触DLBCL细胞可诱导BMSCs表达可溶性B细胞活化因子，从而保护癌细胞免受自发或药物诱导的凋亡。此外，在一项研究基质对接受CHOP或R-CHOP的DLBCL患者治疗反应的影响的研究中，GEP分析确定了两个与TME相关的基因表达特征——预后有利的“基质1”特征涉及与细胞外基质沉积和组织细胞浸润相关的基因，而预后不利的“基质2”特征涉及与内皮细胞活性和肿瘤血管生成相关的基因。其他研究使用基因组、转录组学、蛋白质组学分析和/或免疫组织化学等方法，已经确定并验证了rrDLBCL与治愈病例相比表达上调的其他TME相关基因。一些例子及其涉及的功能是RABGGTB（调节细胞凋亡）、PUS1（蛋白翻译）、POLE（DNA复制和修复）、IDO1（调节T细胞存活和增殖）和CXCL13（编码C-X-C基序趋化因子13）。Xu-Monette 等人通过对405例既往未经治疗的DLBCL患者的样本进行免疫表型分析。发现肿瘤免疫微环境功能受损，以肿瘤浸润T细胞和（或）自然杀伤细胞缺乏为特征，CD8+T细胞上程序性死亡1(PD1)高表达，T细胞和巨噬细胞的程序性死亡配体1(PD-L1)表达与R-CHOP治疗后OS显著较差相关。
宿主变异性
除了药物对个体患者肿瘤中生物靶点的药效学作用外，性别、年龄、体重、药代动力学和多态性等宿主特异性因素的患者间变异性也是DLBCL不良治疗结局的原因。例如，根据在接受R-CHOP的DLBCL患者中研究利妥昔单抗药代动力学的临床研究，与老年女性相比，老年（>60岁）男性患者的临床结局更差。这种治疗缺点被证明是由于利妥昔单抗清除率和血清浓度的差异：利妥昔单抗清除率的年龄依赖性降低仅发生在老年女性中，而未发生在男性中，男性体重较高也有助于其更快地将药物清除。事实上，最近的一项研究提供了交叉试验证据，证明在老年男性患者中增加R-CHOP方案中利妥昔单抗的剂量（从375 mg/m2增加至500 mg/m2）可能改善其PFS，并与接受初始375 mg/m2剂量利妥昔单抗的老年女性患者获得相似的治疗结局。在更广泛的水平上，药物遗传学研究揭示了与患者结局相关的几种编码单核苷酸多态性，以及对细胞毒药物和/或利妥昔单抗的潜在反应（补充表1）。全基因组关联研究的荟萃分析进一步确定了几个预测无不良事件生存率的非编码位点。然而，目前对宿主遗传学如何影响治疗结果的理解似乎是不完整的，因为许多较弱的相关性可能仍有待发现。
补充表1 遗传多态性对DLBCL治疗反应的影响。
DLBCL治疗耐药的分子机制
R-CHOP
虽然到目前为止已经开发了许多成功的联合化疗方案，但很少进行详细的机制研究，说明了对这些多药治疗方案耐药的药理学原理在很大程度上仍不明确。最近，Palmer等人利用综合药理学试验和功能基因组工具研究了R-CHOP中的药物相互作用。他们发现，包括R-CHOP的5种药物没有表现出协同相互作用但交叉耐药性非常低，表明R-CHOP的疗效是由具有非重叠耐药机制的活性药物联合使用所致。这种考虑使研究者能够通过评价肿瘤对单个R-CHOP组分的反应来探究治疗耐药的分子机制。研究者将不关注已在其他地方进行全面综述的利妥昔单抗耐药的拟定分子机制。
在对单个化疗组分的耐药性方面，几项机制研究显示了肿瘤microRNA及其靶标的潜在作用。例如，发现microRNA-155的下调通过上调细胞周期G2/M检查点WEE1促进DLBCL长春新碱耐药，从而抑制细胞周期蛋白依赖性激酶1活性和有丝分裂。microRNA-34a的高表达可能通过下调其靶FOXP1与DLBCL对多柔比星的敏感性增加相关，表明microRNA-34a和FOXP1在多柔比星耐药中的潜在作用。除了肿瘤microRNA，外泌体来源的microRNA也与化疗耐药有关。在对116例接受R-CHOP治疗的DLBCL患者的血清样本和从R-CHOP治疗的DLBCL细胞上清液中分离的外泌体进行分析时，在化疗耐药组与化疗敏感组中检测到上调的外泌体microRNA-99a-5p和microRNA-125b-5p，对上调最高的microRNA的靶向基因进行通路分析，提示AMP激活的蛋白激酶、TGF-β、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR)、和p53信号通路与耐药表型有关。
在这些药物存在的情况下，通过长期孵育体外生成R-CHOP耐药DLBCL细胞系能研究获得性耐药的分子机制。Chen等人最近发现，在R-CHO耐药的DLBCL细胞系模型中，干细胞样特性升高，这是由干细胞相关转录因子SRY-box 2(SOX2)上调介导的。重要的是，与配对治疗前样本相比，在DLBCL患者的复发样本中观察到SOX2表达富集。机制上，发现由黏着斑、B细胞受体 (BCR) 和趋化因子信号激活的磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT通路通过阻止SOX2泛素化介导的降解，使SOX2磷酸化并稳定。研究显示PI3K/AKT抑制可通过破坏SOX2的稳定性促进肿瘤干细胞分化，并且PI3K抑制剂duvelisib与R-CHOP联用可显著抑制体内R-CHO耐药性肿瘤的生长，并延长这些有耐药细胞小鼠的生存期。此外，rrDLBCL在代谢上不同于对R-CHOP敏感的患者，这种代谢差异可能代表了耐药的重要分子机制。Barré等人使用体内异种移植模型和质谱成像揭示了R-CHOP耐药DLBCL中脂质和代谢的分子特征。在耐药样本中发现较高水平的磷脂酰肌醇和鞘磷脂片段以及三磷酸腺苷减少和单磷酸腺苷增加。
总之，尽管需要进一步探索DLBCL化疗耐药的确切原因，但上述结果表明多个分子和信号通路的改变是R-CHOP单药或联合治疗耐药的潜在机制。此外，虽然大多数研究关注治疗耐药的机制，但也需要研究去探索敏感性增强的机制，如最近观察到的TMEM30A功能丧失(LOF)突变与DLBCL治疗结局改善独特相关，这可能可以由多柔比星和长春新碱摄取增加以及巨噬细胞浸润来解释。
表观遗传学治疗
表观遗传失调是DLBCL发病的主要因素，最终导致转录调控改变。研究最多的翻译后染色质修饰包括DNA或组蛋白甲基化和组蛋白乙酰化。编码组蛋白甲基转移酶（例如EZH2）或乙酰转移酶（例如CREBBP和EP300）的基因改变在DLBCL中很常见。例如，EZH2的单个等位基因的功能获得性 (GOF) 错义突变（例如Y641）主要在GCB-DLBCL中报告（约20%），通常导致其产物—zeste同源物2的组蛋白甲基转移酶增强子（EZH2；多梳抑制复合物2(PRC2) 的催化亚基）的活性和稳定性增加。这导致组蛋白3 Lys27(H3K27me3)的高水平三甲基化，从而导致限制增殖（如CDKN1A）或促进分化（如PRDM1）的基因沉默。竞争性EZH2抑制剂（如GSK126和tazemetosta）已在多个临床前DLBCL模型中证明具有抗增殖和促凋亡作用，tazemetosta在rrDLBCL中显示出适度的临床疗效。通过延长孵育体外生成耐药DLBCL细胞系揭示了EZH2抑制获得性耐药的机制。研究表明，促生存胰岛素样生长因子1受体、MEK和PI3K信号转导的组成性激活，导致促凋亡基因TNFSF10和BAD表达的FOXO3依赖性减少，消除了对GSK126获得性耐药的DLBCL细胞中的抗肿瘤作用。此外，几项研究报告了新的获得性EZH2二次突变（例如Y111L、Y661D、C663Y和Y726F），通过阻止这些竞争性EZH2抑制剂的药物结合，从而恢复DLBCL细胞系中甲基化组蛋白的水平，从而作为耐药的诱导剂。有趣的是，这些耐药细胞被证明对UNC1999（EZH1和EZH2的双重抑制剂）和EED226（其他PRC2亚基胚胎外胚层发育蛋白的抑制剂）仍然敏感，表明这种耐药性可能是变构靶向的。在DLBCL患者中是否观察到导致EZH2抑制耐药的继发性突变，有待进一步探索。
其他表观遗传治疗已被评价可作为DLBCL单药治疗的，最显著的是组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 抑制剂，尽管在临床研究中的成功率有限。其应答率低的原因在很大程度上仍未知，但最近的临床前研究显示CDK抑制剂和SRC酪氨酸激酶FGR是HDAC抑制耐药的潜在因素。最近，已阐明特定HDAC亚型的致病作用，主要表明HDAC3抑制是CREBBP突变DLBCL细胞系中一种极具前景的策略。有趣的是，CREBBP突变的DLBCL细胞系也被证明对EP300的活性成瘾，优先易受CREBBP和EP300抑制剂的影响。
靶向治疗
BCR相关激酶抑制剂
BCR及其亚基CD79A和CD79B（共同作为BCR信号复合物）激活近端通路，如脾酪氨酸激酶 (SYK) 和几个下游效应器，包括PI3K/AKT/mTOR、布鲁顿酪氨酸激酶 (BTK) 和NF-κB信号。慢性活性BCR信号在DLBCL中很常见，尤其是ABC亚型，这会引起随后的下游通路激活，促进基因转录失调以及细胞存活和增殖。
BTK 抑制剂 不可逆的BTK抑制剂伊布替尼可阻断BCR依赖NF-κB信号传导，在ABC-DLBCL中优先表现出临床疗效，尤其是MYD88L265P和CD79B突变的MCD亚型。 rrDLBCL 的临床分析显示几种遗传畸变是绕过伊布替尼治疗的假定机制，包括CARD11的GOF、NFKBIE的LOF、TNFAIP3的LOF和IgH-IRF8易位，这些都可能增强NF-κB信号传导。 可导致耐药的获得性突变首次是在慢性淋巴细胞白血病患者样本中得到证实的，但最近在DLBCL的临床前模型中进行了研究。在ABC-DLBCL中，伊布替尼结合位点BTK(BTKC481S) 第481位的错义半胱氨酸至丝氨酸突变与伊布替尼获得性耐药相关。该突变不仅削弱了伊布替尼与BTK形成共价键的能力，从而降低了药物效力，还重新激活了ERK1/2信号转导，分泌促生存和炎性细胞因子（包括白细胞介素-6(IL-6) 和IL-10），以促进ABC-DLBCL细胞存活。此外，KLHL14（一种肿瘤抑制因子，可增加BCR亚基的泛素化，从而降低BCR水平）的缺失，在伊布替尼敏感的MCD-DLBCL细胞系中，通过促进髓样分化初次应答88(MYD88)–Toll样受体9-BCR超复合物的组装和诱导NFκB信号传导的组成过度活化，已证明对伊布替尼产生相对耐药。最近的一项研究进一步表明，对伊布替尼的获得性耐药与PI3K/AKT信号转导的代偿性上调和BTK水平的降低相关，这有助于增强耐药ABC-DLBCL细胞系中的细胞存活率。
PI3K/AKT/mTOR 信号转导抑制剂 PI3K/AKT/mTOR信号转导在调节蛋白合成中很重要，控制细胞存活和增殖；在DLBCL中经常报告该通路的异常活化。在BCR依赖性DLBCL细胞系和体内模型中，SYK或PI3K抑制导致AKT活化减少，从而增加未磷酸化FOXO1的核保留，从而导致活力下降。Chen等人报道了一种涉及C-X-C趋化因子受体 4(CXCR4) 信号的潜在耐药机制。当用SYK或PI3K抑制剂处理BCR依赖性DLBCL细胞系时，通过激活核FOXO1，在转录和细胞表面蛋白表达水平显著上调CXCR4，已被观察为SYK/PI3K阻断的潜在代偿性信号。
Rapamycin类似物如everolimus和temsirolimus是mTOR复合物1(mTORC1)抑制剂，在rrDLBCL中表现出适度的疗效，总缓解率(ORR)为28~30%，中位PFS较短，为2.6个月。耐药机制包括mTORC2诱导的替代AKT激活、mTORC1下游抑制性效应真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1的不完全激活和负反馈环以及平行通路的激活。mTORC1/2双重抑制已被证明可以克服对mTORC1抑制的耐药性，并发挥很强的体外抗肿瘤作用。然而，一项II期研究表明，在rrDLBCL中，mTORC1/2双重抑制剂vistusertib并不优于mTORC1抑制，表明mTORC2诱导AKT激活以外的机制可能发挥更重要的作用。
BCL-2抑制剂
在一半的DLBCL病例中观察到，组成性BCL-2活化导致避免生发中心凋亡程序，促进B细胞淋巴瘤形成。导致BCL-2蛋白高表达的机制各不相同，包括易位（46%的GCB-DLBCL和5%的ABC-DLBCL报告），以及拷贝数增加和/或扩增。选择性BCL-2抑制剂venetoclax在DLBCL中显示出较强的临床前抗肿瘤作用。然而，临床结果并不令人满意，因为在rrDLBCL患者中进行的venetoclax I 期首次人体研究中，ORR仅为18%。DLBCL中的单药venetoclax耐药性可能是由替代抗凋亡信号激活引起的。有证据表明，多个抗凋亡BCL-2家族成员在DLBCL中同时过表达，在耐venetoclax的DLBCL细胞系中检测到抗凋亡因子BCLxL和髓样细胞白血病1(MCL-1)上调。同样，在对另一种BCL-2抑制剂navitoclax产生耐药性的DLBCL细胞系中观察到抗凋亡BCL-2相关蛋白A1和MCL-1的蛋白表达升高，联合MCL-1抑制恢复了这些耐药细胞对navitoclax的敏感性。
免疫疗法
免疫检查点抑制剂：
免疫检查点分子（如PD1和PD-L1）在免疫抑制中发挥重要作用，并已被证明在DLBCL亚群的发病机制中也参与免疫逃逸。这为使用免疫检查点抑制剂增强DLBCL的抗肿瘤免疫应答提供了基础。然而，单药检查点抑制剂通常在rrDLBCL中表现出令人失望的临床缓解率和较短的缓解持续时间。例如，一项Ib期研究报告rrDLBCL患者接受抗PD1抗体nivolumab治疗后的ORR为36%，中位PFS较短，为7周。在ASCT无效或不适合ASCT的rrDLBC 患者的II期试验中，nivolumab的ORR更低（分别为10%和3%）。该研究强调，在DLBCL患者中，PDL1和/或PDL2畸变的频率和幅度较低（16%拷贝数增加水平较低，3%出现扩增），这可能归因于缓解率较低和对PD1阻断的固有耐药性。事实上KEYNOTE-013试验表明，携带PDL1突变（例如拷贝数增加、扩增和/或易位）的rrDLBCL患者中不同抗PD1抗体帕博利珠单抗的ORR显著高于不携带PDL1突变的患者 (67%vs 8%)。这些结果表明，只有选定的遗传和/或免疫标记为rrDLBCL对检查点抑制剂的反应提供了底物。
CAR T细胞疗法：
嵌合抗原受体(CAR)T细胞治疗利用自体T细胞的离体基因修饰，靶向高表达的肿瘤特异性抗原，如CD19，利用T淋巴细胞的细胞毒活性来进行抗肿瘤治疗。目前，基于几项显示生存结局显著改善的单臂临床试验，美国食品药品监督管理局已批准3种CAR T细胞治疗药物用于rrDLBCL。总体而言，CD1工程CAR-T细胞治疗在40~50%的rrDLBCL患者中显示CR，在大多数这些患者中进行接近3年的随访，均可达长期缓解。尽管CAR T细胞独立于T细胞受体-主要组织相容性复合体 (MHC) 相互作用而发挥作用，使其能够克服肿瘤利用逃避免疫监视的共同耐药机制，如MHC表达下降，但其他机制的存在仍可能导致50~60%的rrDLBCL患者对治疗疗效不足。例如，CAR T细胞治疗耐药的一个得到广泛认可的机制是靶标丢失。多项研究显示，rrDLBCL患者接受CAR T细胞治疗后，CD19缺失或CD19和CD22抗原连续缺失。最近，一项研究报告了CD19点突变与高级别B细胞淋巴瘤（包括DLBCL）患者对CAR T细胞治疗耐药相关的临床病例。另一方面，当靶抗原通过替代机制仍以野生型形式存在时，可能发生耐药性。Dufva等人最近发现，在几种DLBCL细胞系中，抑制MEK、SRC、JAK或钙调磷酸酶信号转导会损害CAR T细胞毒性。这些作者进一步表明，FADD或TNFRSF10B的LOF对CAR T细胞毒性具有抗性，突出了死亡受体信号在调节CAR T细胞反应中的作用。重要的是，DLBCL基因组数据集分析显示TNFRSF10B 表达和TP53突变之间呈负相关，这种死亡受体表达的异质性可能导致在临床环境中观察到的CAR T细胞治疗耐药。DLBCL中CAR T细胞失败的其他潜在机制包括T细胞抑制信号传导升高、肿瘤干扰素信号传导和循环抑制性骨髓细胞水平升高以及高频率的CD8 T细胞耗竭。
随着越来越多的临床前和临床研究以及先进技术在DLBCL的应用，人们预期对CAR T细胞治疗和其他新型免疫治疗耐药机制的理解将在未来几年迅速扩展。
DLBCL耐药的合理管理
如上所述，单药新型疗法已显示出治疗rrDLBCL的前景，但仅少数患者因发生耐药而缓解时间较短。因此，合理管理治疗耐药对于最大限度地临床使用这些药物至关重要。这可以通过预防和干预方法来实现（图2）。首先，通过预测治疗反应，将最有可能从某些治疗中获益的患者进行分层，难治性或将产生耐药性的患者不接受这些药物的治疗。此外，实时监测治疗反应能够进行动态风险分析，以便相应调整患者管理，以防止潜在的耐药性发生。 其次，除了预防外，还采用了几种干预措施来克服治疗耐药性。例如，许多临床前和临床研究评价了靶向治疗、表观遗传治疗、免疫治疗和/或免疫化疗的新型组合，以增强治疗反应并克服耐药性。同时，表观遗传化疗增敏和再塑TME显示了为克服DLBCL治疗耐药提供进一步途径的潜力。
预测和监测治疗反应：
预测性生物标志物
预测性而非预后性生物标志物对指导合理使用肿瘤药物，通过有效的患者分层，优化患者获益，避免不必要的治疗，具有重要价值。预测性生物标志物的发现已被证明具有挑战性，在DLBCL治疗的临床环境中仅有少数经过验证的生物标志物。在早期定义的GCB-和ABC-DLBCL COO亚组中指定的遗传事件与对新型药物的某些反应相关，这可能具有预测价值。例如，BCR信号传导抑制剂伊布替尼、来那度胺和硼替佐米已证实在ABC-DLBCL中的缓解率优于GCB-DLBCL。值得注意的是，在80例rrDLBCL患者的I/II期临床试验中，ABC-DLBCL中伊布替尼单药治疗的ORR为37%(14/38)，而GCB亚组中仅为5%(1/20)。此外，在携带BCR突变（活化CD79B突变）的ABC肿瘤中，伊布替尼的缓解率为56%(5/9)，在同时携带MYD88突变的ABC肿瘤中为80%(4/5)。来自最近靶向测序研究的DLBCL亚型与不同的通路依赖性相关联，这为每个亚型的易损通路提供了更精确的假定靶向治疗信息（图2）。值得注意的是，从这些研究中开发的分析算法（例如，LymphGen）显示了将DLBCL患者精确分类为基因亚型的潜力，并提供了相应的建议治疗选择。总体而言，更好地理解DLBCL分类可以系统地识别分子脆弱性，并能够实现DLBCL的个性化治疗，但需要更多的研究来临床验证这些发现。
临床验证的预测生物标志物的另一个例子是生殖系多态性Denovo基因组标记物1(DGM1)，已证明其与蛋白激酶Cβ (PKCβ) 抑制剂enzastaurin的反应高度相关。DGM1的预测价值最早是在III期PRELUDE研究中回顾性发现的，用于对R-CHOP达到CR的DLBCL患者的enzastaurin维持治疗：与DGM1阴性患者相比，DGM1阳性患者的OS显著改善（风险比 (HR)=0.27；p=0.0002）。II期S028研究回顾性生物标志物分析进一步证实了上述结果，该分析显示R-CHOP + enzastaurin治疗的高危DGM1阳性DLBCL患者的OS相比R-CHOP单独治疗显著改善 (HR=0.28；p=0.018)。值得注意的是，在相同的S028研究中，DGM状态不能预测R-CHOP对照组的缓解，揭示DGM1在一线高危DGM1阳性DLBCL患者中作为R-CHOP加用enzastaurin的预测而非预后生物标志物。目前，R-CHOP联合enzastaurin治疗基因组生物标志物为DGM1的高危DLBCL患者的生物标志物驱动的III期ENGINE试验正在进行中。
此外，新出现的数据表明了免疫治疗的几种潜在预测生物标志物。一个例子是恶性B细胞和淋巴瘤浸润T细胞之间的细胞相互作用。根据DLBCL患者样本，4个转录不同的T细胞亚群在TME内表现出显著不同的频率，表明DLBCL可以通过招募异质性T细胞亚群来塑造动态的免疫微环境。这可能有助于预测患者对免疫治疗的反应，因为有证据表明，浸润T细胞稀疏的B细胞淋巴瘤与免疫治疗反应不佳相关。证据还表明，在接受CD19 CAR T细胞治疗的DLBCL患者中，良好的细胞因子谱（以高强度淋巴细胞耗竭相关的高血清单核细胞趋化蛋白-1和IL-7水平为特征）与更好的缓解独立相关，从而使该免疫标记物成为推定的预测性生物标志物。鉴于预测性生物标志物其重要的临床应用和目前的稀疏性，进一步的预测性生物标志物发现和临床验证将是DLBCL治疗耐药管理的优先事项之一。
动态风险分析和风险调整管理
在治疗过程中，患者对癌症治疗的反应是异质性和动态的。因此，实时监测治疗反应为通过实施早期治疗干预避免耐药提供了额外的机会。然而，由于不准确和侵袭性，使用测量肿瘤大小和评估单次活检等常规方法难以实时监测缓解。幸运的是，技术进步已经证明了液体活检作用的证据，例如使用基于无创循环肿瘤DNA(ctDNA)的方法动态监测肿瘤异质性、克隆演变和治疗反应。例如，治疗期间ctDNA的动力学与DLBCL患者对一线和挽救治疗的反应相关。Kurtz等人的研究，一线或挽救治疗1个周期后ctDNA水平下降2个对数的DLBCL患者具有更优的长期获益。这可能是非常有用的，因为应答者和无应答者可以根据第一个周期中点（6~16天）ctDNA的变化进行精确和有效的分层。随后可对无应答者进行相应管理（例如，通过调整剂量、给药方案和/或治疗选择）。此外，新的风险模型，如连续个体化风险指数 (CIRI) 已经开始出现，并显示出使用治疗期间收集的风险预测因子动态和定量描述个性化（DLBCL和其他癌症）患者结局的潜力。CIRI或类似的风险工具可以使早期选择低风险患者进行降级，高危患者进行包含新型药物的替代治疗策略。
新型联合治疗：
为了解决DLBCL对单药新型治疗的耐药性，联合治疗提供了克服靶向癌细胞和/或TME内其他组分中单一或不同途径的多种分子脆弱性的机会。因此，合理确定和严格评价联合治疗是克服DLBCL治疗耐药的重要策略。许多最近发表的研究在DLBCL的临床前和/或临床上研究了不同治疗的新型组合（补充表2）。
补充表2 DLBCL 的新型联合治疗
表观遗传化学增敏和重塑TME
表观遗传化学增敏
染色质的异常表观遗传修饰与化疗耐药的DLBCL相关，表观遗传调节等治疗策略已被证明可诱导化疗增敏。例如，DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂地西他滨被证明可诱导DLBCL细胞亚群的生长抑制，并增强多柔比星在化疗敏感的DLBCL细胞中的抗肿瘤作用。在化疗耐药细胞系中，地西他滨单药在异种移植小鼠中诱导衰老样表型，并使细胞对多柔比星敏感。机制上，SMAD1的高甲基化被证明是化疗耐药的关键因素，SMAD1甲基化的减少与地西他滨治疗和化疗增敏有关。基于这些临床前结果，两项I期试验证实，R-CHOP前DNMT抑制预激（使用阿扎胞苷）可有效促进新诊断的高危DLBCL患者的化疗增敏（以及SMAD1去甲基化）。其他例子包括抑制H3K27去甲基化酶KDM6B，通过诱导BCR依赖性BCL-6 下调和增强细胞凋亡使DLBCL细胞系对化疗药物（长春新碱和多柔比星）敏感，以及 HDAC/组蛋白甲基转移酶抑制剂，通过破坏DNA修复过程、细胞周期进程和细胞凋亡，与利妥昔单抗和多柔比星有协同作用。
重塑TME
鉴于TME在DLBCL发病机制和形成治疗反应中的重要作用，靶向TME除了直接靶向癌细胞外，还作为一种潜在的治疗策略越来越受到重视。事实上，位于TME内的浸润免疫细胞和基质细胞具有遗传稳定性，这使其不易受到突变引起的典型耐药机制的影响。遗传稳定性也代表了较小程度的异质性，这些使得靶向这些细胞变得引人注目。最近的研究在淋巴瘤环境中探索了这一点，尤其是通过调节免疫应答重塑TME。例如，BTK抑制剂伊布替尼已被确定是除直接抗淋巴瘤作用外，首个具有临床活性的不可逆白细胞介素-2诱导激酶 (ITK) 抑制剂，可发挥免疫调节作用。ITK是辅助性T细胞 2(TH2) 存活的必需酶，伊布替尼对其的抑制作用可改变TME中TH1–TH2细胞的平衡，从而在体内淋巴瘤模型中增强TH1导向的抗肿瘤免疫应答。重要的是，与任一单药治疗相比，伊布替尼联合PD-L1阻断改善了淋巴瘤异种移植小鼠的生存期，这与抗肿瘤T细胞免疫应答增强相关。同样，已从PD1抑制的增加T细胞活性的化学筛选中确定了CDK4/6抑制剂。研究进一步表明，CDK4/6抑制在转录而非细胞周期调控中的新作用是增强T细胞活化和体内抗肿瘤免疫应答（例如T细胞分泌IL-2和干扰素γ）。除T细胞活化外，已证实在非GCB-DLBCL细胞系、异种移植小鼠模型和DLBCL患者中，通过阻断免疫检查点CD47可增强利妥昔单抗刺激的巨噬细胞介导的吞噬作用。此外，新出现的证据提供了对表观遗传调节如何影响免疫TME的认识。许多表观遗传学治疗，例如DNMT、EZH2和HDAC抑制剂，可以通过抑制内源性逆转录病毒 (ERV) 的再激活和I型和III型干扰素分泌到TME中诱导病毒模拟，可增强抗肿瘤免疫应答和抗原呈递蛋白（例如，MHC I类）的表达，以增强免疫治疗的疗效。值得注意的是，这些抑制剂也可能以一种不依赖ERV的方式发挥作用，通过例如重新激活TH1细胞型细胞因子表达和增加MHC基因表达（如EZH2和HDAC3抑制剂分别挽救了EZH2突变体和CREBBP突变DLBCL中MHC II类分子的表达）。这些发现为在DLBCL亚类中联合表观遗传治疗和免疫检查点抑制剂提供了有吸引力的依据。
综述结论
近年来发现并评价了许多靶向分子通路、表观基因组和免疫系统的新型药物，以补充R-CHOP治疗DLBCL的疗效。然而，治疗耐药仍然是患者管理的主要挑战。新出现的基因组和表观基因组研究能够对DLBCL进行系统分类，并全面了解肿瘤异质性、克隆演变和治疗反应。洞察分子为揭示个体治疗的耐药机制和确定可特异性靶向增强抗肿瘤反应提供了新途径。这些探索提供了预防和克服耐药性的潜在策略。而且，应用前沿技术，如开发癌症疫苗和进行无偏倚的大规模基于CRISPR–Cas9和化学筛选来定义合理的联合治疗，将进一步帮助管理DLBCL的治疗耐药性。总的来说，随着人们可能步入R-CHOP后时代，未来，理解治疗耐药，合理管理耐药的策略发展以及其在临床中的应用可能变得更加重要。
弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是发病率最高的淋巴瘤亚型，目前临床使用的标准R-CHOP方案可以使大约60%的患者获得临床治愈，但仍有40%患者在治疗或随访过程中出现疾病进展。近年来随着靶向药物包括BTK抑制剂、BCL-2抑制剂、PD1单抗和CAR-T等新型治疗药物虽然一定程度改善这类患者生存，但是总体预后仍然不容乐观。因此深入阐明这类患者对于现有治疗方案耐药机制并提出有效解决方法将有可能改善这类患者的临床预后。
本文针对DLBCL临床耐药的实际问题进行了全面的综述，首先指出肿瘤异质性、肿瘤微环境和宿主因素可能是治疗耐药的主要来源；其后对于目前DLBCL临床常用治疗药物和方案的具体耐药机制进行了详细的总结，包括对于用于一线标准治疗的R-CHOP方案，以及多用于复发难治患者的表观遗传学药物、BCR通路抑制剂、BCL-2抑制剂、免疫检查点抑制剂和CAR-T细胞治疗等靶向治疗药物；然后对于临床如何预测和监测治疗反应提出了建议，包括预测性的生物标志物、动态风险分析和风险调整管理等；最后结合目前临床实践，提出了可能解决临床耐药的策略，包括针对不同耐药机制以及继发代偿反应采用的基于不同治疗机制的联合治疗模式；采用去甲基化药物和组蛋白去乙酰化酶抑制剂等表观遗传学药物使化疗药物增敏，减少耐药；采用ITK抑制剂、CD47单抗、表观遗传学药物等具有免疫调节作用的药物重塑肿瘤微环境以增强临床免疫化疗和靶向治疗的疗效。
总之，本文基于现有DLBCL基础和临床领域的最新研究进展，针对困扰临床的DLBCL治疗耐药问题进行了从基础研究到临床实践的全面总结，并在此基础上结合作者自身经验提出潜在的克服临床治疗耐药的策略，并且进一步对于肿瘤疫苗和CRISPR–Cas9等前沿技术提出展望，期待在现有R-CHOP治疗方案基础上，进一步提高和改善DLBCL患者生存。
He MY, Kridel R. Treatment resistance in diffuse large B-cell lymphoma. Leukemia. 2021 Aug;35(8):2151-2165. doi: 10.1038/s41375-021-01285-3. Epub 2021 May 20. PMID: 34017074.
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