近期，发表在《肿瘤学》杂志【Cancers (Basel)】上一篇题为CAR-NK Cells：A Chimeric Hope or a Promising Therapy？的综述，总结了嵌合抗原受体自然杀伤细胞（CAR-NK）的来源、发展技术、前沿进展、潜在优势和面临的挑战，并展望了其应用前景。
背景
近年来，基于过继免疫细胞疗法的创新治疗为血液系统恶性肿瘤领域带来了新的曙光。区别于传统的化疗方案，包括嵌合抗原受体（CAR）T细胞在内的经过基因改造的免疫细胞能够甄别肿瘤细胞，并利用其细胞毒性对抗肿瘤细胞；CAR-T细胞治疗已经改变了复发/难治性B细胞恶性肿瘤的治疗格局。然而，这些过继免疫细胞疗法的临床应用依然面临着疗效和来源受限、副作用严重以及价格高昂等诸多挑战。嵌合抗原受体自然杀伤细胞（CAR-NK）提供了一种很有前景的新选择。NK细胞的来源纷杂，包括细胞系、脐带血、外周血和诱导多能干细胞，可以在异体基因环境下使用，且没有重大的毒副作用。相较于T细胞，CAR-NK细胞的设计难度更大，也需要制定更标准化的扩增和转染方案。
NK细胞生物学特性：多渠道杀伤、多种识别受体，可针对免疫逃逸恶性细胞
自然杀伤（NK）细胞是构成先天免疫的一种淋巴细胞，在恶性细胞和病毒感染细胞的免疫监测中具有重要作用。NK细胞能够以抗原独立的方式介导杀伤效应，通过分泌穿孔素/颗粒酶颗粒，以及表达FasL或TRAIL等因子激活死亡受体诱导细胞凋亡；也能够通过由Fc受体CD16（FcyRIII）介导的抗体依赖的细胞毒性（ADCC），启动抗体包被的细胞脱颗粒。此外，NK细胞还能产生许多细胞因子，例如干扰素、肿瘤坏死因子TNF-α等，促进恶性细胞裂解。对于因MHC I类分子缺失而逃逸T细胞免疫监控的恶性细胞，NK细胞同样能够发挥杀伤作用。
NK细胞表面识别受体众多，包括抑制型受体和激活型受体。既往研究利用流式细胞术发现，NK细胞不表达识别自身MHC I类的抑制性受体。根据CD56的表达强度，可将NK细胞分为两个亚群。CD56表达较低的亚群约占循环NK细胞的90%，具有很强的细胞毒性，多为主要表达CD16的成熟NK细胞。高表达CD56的未成熟NK细胞占循环NK细胞的10%，主要存在于淋巴结和其他器官中，细胞毒性低、增殖能力强。
图1.NK细胞的细胞毒性：激活和抑制之间的平衡。(A) 在自体环境中，NK抑制性受体（例如 KIR 或CD94/NKG2A）识别自身 HLA I 类配体。15个自体健康细胞的癌症不表达任何应激配体；抑制信号占主导地位。(B) 红细胞不表达 HLA I 类分子或应激配体；抑制信号占主导地位。(C)(C1)：应激细胞（肿瘤或病毒感染细胞）可以负性调节HLA-Ⅰ类配体，表达激活应激配体。(C2)：半相合受体白血病细胞表达激活应激配体和HLA-Ⅰ类分子，不被供体 NK 细胞识别。同种异体反应性供体 NK 细胞通过 KIR 配体错配杀死受体肿瘤细胞。(D)NK 细胞表达Fcγ受体如CD16。CD16 与抗体的 Fc 区结合，后者与肿瘤抗原结合并引起 NK 细胞脱颗粒。
干细胞移植中同种异体NK细胞体现出抗肿瘤作用，CAR-NK提供过继细胞疗法新思路
许多血液系统恶性肿瘤都无法依靠单纯的化疗或放疗实现治愈，同种异体造血干细胞移植是当今大量血液肿瘤唯一的治愈希望。然而，异体移植可能造成供体的免疫系统（本质上是同种异体T细胞）激活并损伤受体，即移植物抗宿主病（GVHD）。为了减少移植物抗宿主病的发生，近年来单倍同体家族造血干细胞移植的应用更为频繁，即例如父子、叔父、堂兄等的HLA单倍型用于移植。在这种特殊情况下，来自供体的单倍体NK细胞可以被激活。理论上说，NK细胞具有更强的可塑性，易于适应移植环境，其细胞毒性也相对较低，这使得学界愈发关注NK细胞在单倍同源造血干细胞移植中的潜力。
CAR-T细胞的发展已经以一种前所未有的方式彻底改变了抗肿瘤免疫细胞治疗。这种基因工程处理、表达特定靶向抗原受体的T细胞产品，已经过多次迭代并成功进入临床。靶向CD19或BCMA的CAR-T细胞治疗在弥漫大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、滤泡性非霍奇金淋巴瘤（NHL）和骨髓瘤中各有亮眼表现。然而，CAR-T疗法在实践中仍然面临许多障碍。患者的免疫系统状态与收集到的T淋巴细胞质量密切相关，这使得CAR-T细胞的制备过程复杂而漫长，且非常昂贵，可及性亟待提高。此外，CAR-T疗法的副反应也不容忽视；其诱导的细胞因子释放综合征（CRS）引起的炎症或神经、血液学损伤，以及脱靶效应、抗原靶点丢失导致的耐药等，都可能对患者造成严重的负面影响。基于此，CAR-NK细胞的理念横空出世，旨在为血液肿瘤患者提供更佳的治疗选择。
CAR-NK细胞：不引起移植物抗宿主病，制备简单成本低、但寿命短设计难
NK细胞的活性完全独立于抗原和HLA；若供体NK细胞和受体肿瘤细胞之间的HLA不相容，可以通过KIR与KIR配体的错配促进NK细胞的同种异体抗肿瘤反应性。值得关注的是，与同种异体T细胞不同，NK细胞不会引起移植物抗宿主病。造成这一现象的原因尚不完全清楚，但NK细胞的激活受体可能是其中的关键。健康的非应激宿主组织表面不存在应激诱导的配体，或可使其免于NK细胞毒性。在HLA不相容的同种异体干细胞移植小鼠模型中，供体NK细胞甚至能够通过破坏受体的抗原呈递细胞来对移植物抗宿主病，发挥保护作用。这种对受体免疫系统的影响有利于巩固移植疗效并减少移植副反应，供体NK细胞也不太容易受到免疫排斥。
同种异体NK细胞的制备在时间和成本方面具有很大的优势；CAR-NK细胞具有所有这些优势，同时也存在一定的限制。CAR-NK细胞的寿命相对较短，持续时间约为1-4周。研究表明，氟达拉滨和环磷酰胺诱导的淋巴耗竭对NK细胞的扩增至关重要，IL-15是一个重要的预测因子；NK细胞在体内的扩增也需要外源IL-2的注射，这可能导致显著毒性。在CAR-NK细胞的构建中加入IL-2和IL-15等细胞因子有助于其扩增和持久存续。
NK细胞体外扩增和活化正在研究中，但何种条件下能获得更高的扩增速率并避免细胞耗竭仍存在争议。此外，CAR-NK细胞的设计较为困难，NK细胞对凋亡的敏感性高，基因表达水平较低。目前，将基因导入NK细胞最成功的方法是通过电穿孔实现快速瞬间表达，或通过病毒载体转染实现持续的低表达。相关基因工程手段的优化有望促进CAR-NK细胞的广泛应用。
此外，肿瘤微环境对NK细胞具有不利影响，可下调NK细胞的代谢活性，严重阻碍NK细胞抗肿瘤作用。额外增加IL-15或导入编码趋化因子受体转基因都有助于促进CAR-NK细胞向肿瘤部位转运。联合免疫检查点抑制剂也有望克服肿瘤微环境的抑制作用，释放CAR-NK细胞的全部潜能。以上方案已在动物模型中得到确证，但仍需在临床研究中证明其效果。
CAR-NK细胞的来源
NK细胞具有良好的安全性，在淋巴细胞群体中占有相对较大的比例。NK细胞来源广泛，许多来源的NK细胞已得到开发，被用于产生同种异体的CAR-NK细胞。
1. NK-92细胞系
NK-92是一种白细胞介素（IL）-2依赖、EBV阳性的NK细胞系，来自于一名患有快速进展的非霍奇金淋巴瘤的50岁白人男性。NK-92具有很强的细胞毒性，表型包括激活受体NKp30、NKp46和NKG2D。其表面唯一的抑制性受体是ILT2、CD94-NKG2A（识别HLA-E）和抑制性KIR受体KIR2DL4，表达水平较低，因此对患者HLA分子的抑制非常有限。NK-92表面不表达CD16，无法发挥ADCC效应。
NK-92非常便于使用，理论上可以大量生产，在细胞数量、时间和成本方面都有巨大的优势。但鉴于其肿瘤性质，源于NK-92细胞系的CAR-NK细胞在注射前需要接受辐照，改变细胞寿命和分裂状态；这导致其增殖能力急剧下降，注射7天内即会消失，需多次注射。CAR-NK-92细胞已在复发难治性AML、骨髓瘤领域进行了初步的尝试，安全性与耐受性良好，但疗效有待进一步确证。未来CAR设计的迭代也有助于提高NK-92细胞系衍生CAR-NK细胞的效率。
2. 来自脐带的NK细胞
脐带血是一种丰富的NK细胞来源。脐带NK细胞占淋巴细胞的15% - 30%，表型相较于成人外周血中的更不成熟，相比细胞毒性更具有增殖能力；然而，这些限制可以通过体外扩增、细胞因子诱导或转染来克服。
脐带血中的NK细胞具有非常重要的增殖能力，对细胞动力学刺激非常敏感。I/II期临床试验已经评估了脐带NK细胞的治疗潜能，发现注射NK细胞后接受维持治疗的患者缓解状态和NK细胞保持得较好，这些维持治疗手段包括来那度胺、利妥昔单抗、维奈克拉或干细胞移植等。IL-15基因被认为在CAR构建中增加了CAR- NK细胞的持久性，但相关机制尚未阐明。由于从冷冻细胞中选择NK细胞的效率很低，无法使用来自国际冷冻库的脐带血生产CAR-NK细胞；从新鲜脐带血中扩增细胞、培养才是合适的策略。
来源于脐带血的 CAR-NK 细胞：
3. 来自外周血的NK细胞
大多数采用过继NK细胞治疗的研究都是从淋巴组织中获得淋巴细胞，然后在清除T淋巴细胞和B淋巴细胞后富集NK细胞，并筛选出CD56阳性的群体、使用IL-2激活。外周循环NK细胞相比脐带NK细胞增殖能力较低，细胞毒性更强。
基于动物模型的研究显示，细胞因子诱导的记忆NK细胞表达IL-12、IL-15和IL-18，具有增强的抗肿瘤反应，能够显著降低肿瘤负荷、提高生存率。通过转导激活受体，可以衍生包括记忆T细胞和NK细胞在内的外周血单核细胞。在体外，记忆T细胞的转导比NK细胞更稳定；但CAR-NK细胞表现出更强的抗骨髓瘤活性，同时能够保护健康细胞免受损伤。使用CRISPR/Cas9和腺病毒转导技术，已经能够产生CD33靶向的CAR-NK，有望应用于对抗白血病。
4. 来源于诱导多能干细胞的NK细胞
诱导多能干细胞（iPSC）是通过基因重组成为多能干细胞的分化细胞。成熟分化细胞向iPSC诱导的过程包括对该细胞进行基因修饰，使其表达Klf4、C-myc、Oct3/4和Sox2基因，重获无限增殖与分化的潜力。诱导多能干细胞可用于产生通用的CAR-NK“现货”产品，随时可以使用。这类NK细胞通常表型不成熟，细胞毒性差但具备很强的增殖能力，可上调CD16和IL-15/IL-2的表达增益其杀伤功能与存续时间。
FT596是首个来自iPSC、“现货”通用型同种异体CAR - NK细胞产品，已经在美获批临床。FT596由一种针对NK细胞优化的抗CD19 CAR组成，具有激活因子受体NKG2D的跨膜结构域、2B4共刺激结构域和CD3信号域。与诸如利妥昔单抗等单克隆抗体联用时，FT596的hnCD16 Fc受体能够结合肿瘤细胞表面抗体的Fc段，激活并分泌细胞因子，发挥增强的ADCC效应。该产品目前已在临床研究中展现出初步疗效，并计划启动一项包含285名患者的I期研究（clinicaltrials.gov：NCT04245722）。
总结
同种异体的CAR-NK细胞为血液系统恶性肿瘤的治疗提供了全新的视角。迄今为止，同种异体NK细胞面临着相对较短的持久性、缺乏标准化和高效率的转导手段等诸多问题。随着CAR设计的不断完善，以及IL-15或稳定CD16带来的与ADCC增强相关的结构改造，CAR-NK疗法的潜力仍在不断被发掘。与CAR-T细胞相比，CAR-NK领域的探索依然不够深入。鉴于NK细胞来源广泛，信息众多，如果能够建立一个毒性较小、疗效维持时间更长的异体基因CAR-NK治疗策略，则将有助于在血液肿瘤领域进一步扩展其应用前景。
Sabbah M，Jondreville L，Lacan C，Norol F，Vieillard V，Roos-Weil D，Nguyen S. CAR-NK Cells：A Chimeric Hope or a Promising Therapy? Cancers（Basel）. 2022 Aug 8；14（15）：3839. doi：10.3390/cancers14153839. PMID：35954502；PMCID：PMC9367380.
责任编辑：Luna
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