近期，发表在《血液学》杂志（Blood）上一篇题为Dual-antigen targeted off-the-shelf NK cells show durable response and prevent antigen escape in lymphoma and leukemia的文献，基于体外细胞模型与体内小鼠肿瘤模型，评估了三重基因修饰的iDuo NK细胞联合或不联合利妥昔单抗，直接作用于恶性B细胞系和原代CLL细胞的初步疗效。该研究结果或有望为抗原丢失、肿瘤逃逸的B细胞白血病和淋巴瘤的治疗提供新的多抗原靶向策略。
研究背景
随着CD20特异性抗体利妥昔单抗和靶向CD19的嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗的应用，B细胞白血病和淋巴瘤的治疗得到了改善。然而，既往研究显示，部分患者利妥昔单抗治疗期间会出现CD20的丢失；此外，还有高达50%接受抗CD19 CAR-T细胞治疗的患者在一年内复发，这些患者中也有很多表现出CD19丢失。因此，临床亟需新的治疗方法来防止肿瘤抗原逃逸。
为了解决这部分患者的临床需求，该研究生成了一种三重基因修饰、诱导多能干细胞（iPSC）衍生的自然杀伤细胞（iNK）细胞产物，并将其命名为“iDuo”NK细胞。这种细胞既具备不可切割的CD16（hnCD16）CAR提供的抗体依赖细胞毒性（ADCC），可以直接有效地杀伤肿瘤，还具备膜结合IL-15/IL-15R融合分子（IL-15RF）提供的细胞因子自主功能。该研究探索了iDuo NK细胞联合利妥昔单抗，发挥抗CD19 CAR介导的细胞毒性和ADCC的能力。与单纯的抗CD19 CAR-T细胞相比，iDuo NK细胞相对于健康B细胞更倾向于靶向恶性B细胞，较少产生脱靶效应。此外，该研究还证明了iDuo NK细胞在体内对B细胞肿瘤的控制作用。这一临床前数据支持iDuo NK细胞在B细胞白血病和淋巴瘤治疗中的临床转化。
研究方法
通过在StemPro34培养基中添加BMP4和bFGF，诱导人类诱导性多能干细胞（iPSC）向中胚层和CD34+造血祖细胞阶段分化。CD34+细胞富集后，诱导其沿着NK细胞谱系分化。培养20-30天后，收集iNK细胞，与转染后膜结合IL-21和4-1BB配体（4-1BBL）的辐照K562细胞共培养2- 4周。iDuo NK细胞来源于一个克隆的人类iPSC系，表达转基因编码的hnCD16和IL-15RF16，以及一个抗CD19的CAR结构；包含NKG2D信号域，与2B4和CD3ζ信号域耦合。
体外试验评估了iDuo NK细胞对B细胞白血病及淋巴瘤细胞系、健康B细胞和原代CLL细胞的细胞毒性。用CellTrace Violet染料对受检细胞系进行标记后，扩增的PBNK细胞、未转导的iNK细胞和iDuo NK细胞与接受标记的细胞共培养5小时，分别加入或不加入利妥昔单抗（1 μg/ml），然后进行流式细胞术分析，测定细胞特异性杀伤百分比。
图1 体外共培养产生iDuo NK细胞
使用NSG小鼠进行体内试验，构建Nalm6急性淋巴细胞白血病小鼠模型。在肿瘤形成1天后，小鼠不接受治疗，或是接受iDuo NK细胞治疗。构建Raji淋巴瘤小鼠模型，在肿瘤形成1天后，小鼠不接受治疗，或是接受利妥昔单抗单药注射，或接受iDuo NK细胞单独治疗，或接受iDuo NK细胞与利妥昔单抗同时注射。每周进行生物发光成像以监测肿瘤进展，当小鼠出现发病迹象时处死；抽血并通过流式细胞术评估细胞计数，以区分过继转移的细胞。
研究结果
1. 与利妥昔单抗联合使用时，许多NK细胞表现出增强的抗CD19 CAR介导的细胞毒性和hnCD16介导的ADCC效应
流式细胞术检测显示，iDuo NK细胞表面抗CD19 CAR，hnCD16和IL-15RF的表达是一致的，在iDuo NK细胞表面常规观察到抗CD19 CAR的频率超过90%。在iDuo NK细胞、未转导的iNK细胞和外周血NK（PBNK）细胞与Daudi、JeKo-1、Raji和AHR-77细胞共培养的实验中，我们评估了CAR的功能，并确定了一系列B细胞恶性肿瘤对iDuo NK细胞细胞毒性的敏感性。实时成像IncuCyte分析监测了长期杀伤的效果，结果显示未转导的iNK细胞和激活的PBNK细胞活性有限，而iDuo NK细胞体现出显著提高的细胞毒性。
通过基因敲除，研究验证了hnCD16、IL-15RF对于介导ADCC的重要性。此外，体外共培养在加入利妥昔单抗后，观察到iDuo NK细胞的细胞毒性显著增加，IFN-γ等细胞因子产生的频率明显提升。以上结果表明，iDuo NK细胞可以通过CAR的参与，通过hnCD16的重定向方式以及固有免疫中的细胞毒性，直接有效地溶解淋巴瘤细胞。
2. 在肿瘤异质性和抗原逃逸的体外模型中，iDuo NK细胞能够有效消除表达CD19的B淋巴母细胞和淋巴瘤细胞
抗原逃逸和肿瘤异质性可以使CAR-T细胞治疗失效。为了在体外模拟这一过程，研究建立了一种共培养模型，将野生型CD20+/CD19+的AHR-77细胞转染NucLightRed，CD20+/CD19-的AHR-77细胞转染NucLightGreen。将这两种细胞群混合培养，作为有或无利妥昔单抗靶点的治疗目标。利妥昔单抗和未转导的iNK细胞介导了部分CD20+/CD19+ AHR77和CD20+/CD19- AHR77细胞裂解，抗CD19的CAR iNK细胞则优先靶向CD20+/CD19+的AHR-77细胞。单独使用iDuo NK细胞对CD20+/CD19+ AHR-77细胞具有高度的细胞毒性，而使用利妥昔单抗可以消除CD20+/CD19- AHR-77细胞。
在没有利妥昔单抗的情况下，PBNK细胞、未转导的iNK细胞、iDuo NK细胞分别与CD20+/CD19+ AHR-77细胞和CD20+/CD19- AHR-77细胞共培养的结果显示，PBNK细胞和未转导的iNK细胞对两种恶性细胞都仅有中等的细胞毒性，而iDuo NK细胞以剂量依赖的方式介导了高效和持久的杀伤效果，并表现出更有效的早期杀伤能力；但肿瘤控制能力随着时间的推移而减弱。在加入利妥昔单抗的情况下共培养后，iDuo NK细胞也介导了对AHR-77细胞的强而持久的细胞毒性。
因此，在缺乏CD19抗原的情况下，抗CD19 CAR-T细胞和iDuo NK细胞仍保有适度的细胞毒性，在模拟抗原逃逸的环境中发挥有效的杀伤作用；当与利妥昔单抗联合时，iDuo NK细胞能够发挥强大而持久的细胞毒性功能。
3. iDuo NK细胞能有效杀伤源自患者的白血病细胞，并优先靶向恶性B细胞
为了评估iDuo NK细胞对原代白血病细胞的作用，研究者将扩增的PBNK细胞、未转导的iNK细胞和iDuo NK细胞与来自5个不同患者、染色标记的CLL细胞共培养，加入或不加入利妥昔单抗。所有患者样本都含有高比例的CD19阳性CLL细胞。结果显示，PBNK细胞单独对CLL靶点没有表现出显著的细胞毒性，需要与利妥昔单抗联合才能诱导肿瘤杀伤。相比之下，iDuo NK细胞作为单一药物即可介导CLL细胞的高特异性杀伤，加入利妥昔单抗后杀伤效果进一步增强，接近完全消除CLL靶点。
既往抗CD19 CAR-T细胞治疗可能导致长时间的B细胞再生不全，造成对B细胞生态位的持久损害；这一负面影响的持久性远远超过抗CD19 CAR-T细胞的作用时间。NK细胞表达激活和抑制受体，能够帮助区分健康和恶性细胞。该研究将iDuo NK细胞与肿瘤细胞和收集自健康供者的外周血单核细胞混合共培养，并使用流式细胞术检测caspase 3/7断裂、评估细胞毒性。结果显示，iDuo NK细胞表现出对肿瘤细胞明显更高的杀伤作用，即使肿瘤细胞和健康B细胞都表达CD19。这一点在Raji细胞和Nalm6细胞中都得到了体现，iDuo NK细胞对恶性细胞具有优先的细胞毒性。
为了进一步研究iDuo NK细胞对健康和恶性B细胞效应的区别，研究探索了激活受体NKG2D状态对iDuo NK细胞作用的影响。结果显示，NKG2D阻断降低了iDuo NK细胞共培养中健康B细胞与恶性B细胞的比例，但没有降低抗CD19 CAR-T细胞共培养中两种细胞的比例。这提示NK细胞表达的、包括NKG2D在内的一系列激活受体，对于其杀伤的选择性有关键影响。此外，与未转导的iNK细胞相比，iDuo NK细胞上的激活受体水平更高；iDuo NK细胞介导原发性CLL细胞强杀伤效果、同时对健康B细胞的细胞毒性更小，可能是由于NKG2D等受体的激活。
4. 没有外源性细胞因子的情况下，iDuo NK细胞仍然能够长期存活
由于IL-15RF增强了iNK细胞的细胞毒性，研究进一步确证了其是否有助于维持iDuo NK细胞的功能与持久反应。将抗CD19 CAR-iNK细胞和iDuo NK细胞与Nalm6细胞共培养，添加或不添加IL-2后，结果显示，用IL-2培养的抗CD19 CAR - iNK细胞最初显示出强大的杀伤能力，其后肿瘤细胞又逐渐增加。在不含IL-2的情况下培养的抗CD19 CAR - iNK细胞也表现出最初的细胞毒性，然而肿瘤细胞在20小时后迅速增加。相比之下，iDuo NK细胞在有无IL-2的情况下都能有效地清除Nalm6细胞。这种内在的维持功能使得iDuo NK细胞在没有细胞因子支持的情况下，也能够常规扩增、发挥持久功效。
图2 iDuo NK细胞与Nalm6细胞共培养，添加或不添加IL-2
为了测量体内持久性，NSG小鼠接受3周剂量的非转导iNK细胞或iDuo NK细胞，添加或不添加IL-2。第一次细胞注射后3周和4周抽血，第28天采集骨髓和脾脏组织，用流式细胞术检测iNK细胞数量。结果显示，在第3周和第4周，无论小鼠是否接受IL-2，小鼠外周血中iDuo NK细胞数量都显著高于未转导的iNK细胞。在骨髓和脾脏组织中也观察到同样的趋势。
在Nalm6肿瘤NSG小鼠模型中，在不添加外源性细胞因子、联合或不联合利妥昔单抗的情况下，评估iNK细胞或iDuo NK细胞的治疗效果。每周抽血进行检测，4周后处死小鼠进行骨髓和脾脏分析。结果显示，相对于未转导的iNK细胞，iDuo NK细胞具有显著的持久性优势。肿瘤细胞和利妥昔单抗的存在与否不影响脾脏中的iDuo NK细胞数量。体内外的研究数据均表明，iDuo NK细胞在缺乏外源性细胞因子的情况下仍能发挥作用，并能够在血液、脾脏和骨髓中存续大量NK细胞。
5. 在Nalm6急性淋巴细胞白血病模型中，iDuo NK细胞表现出强大和持久的体内抗肿瘤功能
研究者在基于小鼠的异种移植模型中评估了iDuo NK细胞作为单一疗法的作用。给小鼠注射Nalm6-luc细胞构建模型后，每3周给各组小鼠注射iDuo NK细胞和IL-2。结果显示，Nalm6在肿瘤模型小鼠中呈指数增长；连续注射iDuo NK细胞的小鼠模型中，肿瘤负荷得到了有效控制，直到第21天肿瘤几乎不再生长。接受iDuo NK细胞治疗的小鼠也具有显著的生存优势。这些结果共同证明了iDuo NK细胞单药治疗Nalm6急性淋巴细胞白血病模型的有效性。
图3 Nalm6淋巴瘤模型小鼠生存情况
6. iDuo NK细胞联合利妥昔单抗在Raji淋巴瘤模型中产生持久的抗肿瘤反应
使用更具侵袭性的Raji细胞构建的淋巴瘤小鼠模型中，iDuo NK细胞联合利妥昔单抗实现了良好的效果。
在未接受治疗的小鼠中，肿瘤负荷成倍增长。接受iDuo NK细胞的小鼠在早期表现出适度的肿瘤控制，然而其后肿瘤逐渐恢复生长。给予利妥昔单抗的小鼠肿瘤水平较低，且iDuo NK细胞和利妥昔单抗的联合使用与持久的抗肿瘤反应相关。与单独使用利妥昔单抗的小鼠相比，使用iDuo NK细胞联合利妥昔单抗治疗的小鼠存活时间显著延长（51天 vs 38.5天）。
图4 Raji淋巴瘤模型小鼠生存情况
研究讨论
既往已经有多项临床试验评估NK细胞治疗晚期B细胞淋巴瘤和白血病患者的效果，虽然一些患者获得了部分缓解，但该方法的总体疗效有限。为了促进直接参与和增强效应功能，NK细胞免疫疗法现在正转向以CAR修饰为中心的策略。本研究使用的三重基因修饰的iDuo NK细胞，源于iPSC通过基因工程和克隆衍生。其CD19 CAR能够提供精准靶向，IL-15RF能够增强效应持久性，使之不需要外源性细胞因子支持，即可精准靶向恶性细胞，发挥ADCC作用；与治疗性单抗联合时使用或能产生更佳效果。这种多路同步编辑的iPSC生产线可用于连续生产iDuo NK细胞，无需多余的基因工程或富集步骤，提高了产品制造的一致性、降低了成本，有利于促进后续的临床转化和药物可及。
研究通过体内外的探索，确证了三重基因修饰的iDuo NK细胞通过自然杀伤作用、抗CD19 CAR信号靶向以及hnCD16与利妥昔单抗介导的ADCC，直接作用于恶性B细胞系和原代CLL细胞的精准疗效。在抗原逃逸的NK细胞模型中，iDuo NK细胞实现了相较于PBNK细胞、未转导的iNK细胞、抗CD19 CAR- iNK细胞或原代抗CD19 CAR- T细胞更佳的消除恶性细胞能力。与利妥西单抗联合时，iDuo NK细胞能够引起持久的抗肿瘤反应。基于动物模型的体内重现了细胞试验的结果，iDuo NK细胞对于Nalm6 B-ALL模型能够介导的快速和持久的抗肿瘤效应，联合利妥昔单抗对于Raji淋巴瘤模型具有良好的杀伤效果。且值得关注的是，与健康的B细胞相比，iDuo NK细胞对恶性B细胞的特异性杀伤水平明显更高；这一特征在临床中可能具有相当重要的意义，有助于减免过继细胞疗法的脱靶效应。iDuo NK细胞或将为临床提供一种新的多抗原靶向策略，有望克服肿瘤异质性和抗原逃逸；相关研究结果将在针对B细胞淋巴瘤的I期临床试验（clinicaltrials.gov注册号：NCT04245722）中接受进一步的评估。
Cichocki F, Goodridge J, Bjordahl R, Mahmood S, Davis ZB, Gaidarova S, Abujarour R, Groff B, Witty AD, Wang H, Tuininga K, Kodal B, Felices M, Bonello GB, Huffman J, Dailey T, Lee TT, Walcheck B, Valamehr B, Miller JS. Dual-antigen targeted off-the-shelf NK cells show durable response and prevent antigen escape in lymphoma and leukemia. Blood. 2022 Aug 2:blood.2021015184. doi: 10.1182/blood.2021015184. Epub ahead of print. PMID: 35917442.
责任编辑：Luna
排版编辑：Luna
苏公网安备 32059002004080号
