张琪，陈米芬 翻译；王晰程 审校
北京大学肿瘤医院消化肿瘤内科
原文出处: Antonarelli, G. et al. Therapeutic cancer vaccines revamping: technology advancements and pitfalls. Annals of Oncology, Volume 32, Issue 12, 1537 - 1551.
本文将特邀南京大学医学院附属鼓楼医院魏嘉教授进行解读与点评，敬请继续关注。
摘要
【关键词】癌症，疫苗，免疫疗法
引言
癌症免疫治疗（cancer immunotherapies，CI）是肿瘤学中最有前景的领域之一[1]，其主要目的是增强免疫系统对肿瘤细胞的识别，从而获得可能的疾病控制或生存获益。
CI包括细胞治疗、抗体、细胞因子、溶瘤病毒（oncolytic viruses，OV）和癌症疫苗（cancer vaccines，CV）[2,3]。历史上，早期的CI尝试了使用全身细胞因子，但其不良反应限制了其临床应用[4]。多年来，人们对分子生物学、基因组学和癌症免疫学方面的知识不断增长，促进了新靶点和治疗方法的发现[2,5,6]。嵌合抗原受体T（chimeric antigen receptor T，CART）细胞和免疫检查点阻滞（immune checkpoint blockade，ICB）治疗是其中典型的例子。这两种策略在不同恶性肿瘤中显示出的临床获益[7-10]，不仅使其获得监管机构的批准，还荣获了2018年诺贝尔医学奖[7,11-14]。但是无论哪种CI都面临各种各样逃逸机制的困扰，包括抗原/人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）丢失、免疫庇护部位的转移以及不可预测的全或无或分离的应答反应[15-17]。
已有研究对CV激活癌症特异性应答和建立长期免疫记忆的能力进行了检验，然而其结果比较令人失望，大多数制剂未能显示出临床获益，只有一种名为Sipuleucel-T（Provenge）的CV在2010年获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准[18-20]。
在过去的一年中，为应对2019冠状病毒病（COVID-19）大流行，破纪录的疫苗研发速度依赖于CV研究中已经建立的制造基础设施和技术平台[21]。新的疫苗生产系统如基于基因的平台等首次被引入到大规模的疫苗生产活动中。BNT162b2和mRNA-1273是最早被FDA批准用于COVID-19的两个疫苗，这两个疫苗创纪录的获批时间凸显了它们良好的安全性、免疫原性和有效性[22-27]。
本文将聚焦于癌症疫苗学中尚未解决的主要问题，提供有关不同平台技术改进的见解，探讨临床转化领域尚待解决的问题。
需要解决的生物和临床问题
经典的CV平台分为四种类型，分别是基于病毒/细菌型、基因型、肽型和细胞型，如图1所示。
图1. 用于癌症治疗的主要疫苗制剂。
已经研发的四种以治疗为目的的疫苗平台：基于病毒/细菌、基于基因、基于肽和基于细胞的疫苗[27]。本图描述了每种不同策略的示例。APC：抗原提呈细胞；DC：树突状细胞；HSV-1：单纯疱疹病毒1型；IFNγ：干扰素γ；IL-2：白细胞介素-2；mRNA：信使核糖核酸；TNF：肿瘤坏死因子；T-VEC：Talimogene laherparepvec。
迄今为止，大多数CV临床试验都使用了基于细胞、病毒或肽的平台，这归功于已有的关于安全性、免疫原性和生产工艺的相关知识[18,28]。直到2014年底，已经进行了451个CV临床试验，其中基于基因的CV制剂占比<5%[29,30]。值得注意的是，III期和II期临床试验的比例低至1：21，凸显了药物研发过程中的严重瓶颈[30]。此外，大多数III期试验最终未能证明其疗效[29]。例如，在非小细胞肺癌辅助免疫治疗（Adjuvant Non-Small Cell LunG CanceR ImmunoTherapy）试验中，手术切除后的非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）患者接受重组抗MAGE-A3蛋白疫苗治疗，与接受安慰剂治疗相比，无疾病生存期（disease-free survival，DFS）并未延长[31]。同样，在TeloVac试验中，与标准化疗相比，GV1001（一种基于肽的靶向端粒酶疫苗）的加入并未改善局部晚期/转移性胰腺癌患者的总生存期（overall survival，OS）[32]。总的来说，这些结果可能源于未优化的疫苗接种策略、不理想的抗原选择或尚未探索的组合策略。
然而，尽管许多其他CV未能在III期试验中证明其疗效，但对整个领域的探索从未停止过[33]。事实上，来自不同平台的几乎所有试验有力证明了CV良好的毒性特征和免疫原性[30]，这是癌症疫苗学推进、研发新的平台和试验设计并最终获得积极的疗效结果的两大基础支柱[29,34]。在大量的研究失败之后，一些关键问题经过优化并达到了预期，由此推动了整个领域的复兴[35]。
抗原选择
可靶向的抗原分为两类：肿瘤相关抗原（tumor-associated antigens，TAA）和肿瘤特异性抗原。前者是非突变蛋白，要么过度表达（如人表皮生长因子受体2或端粒酶）或组织分化的一部分（即酪氨酸酶、Melan-A），要么是癌症胚系（即MAGEs、NY-ESO），并且不一定是肿瘤特异性的。相反，肿瘤特异性抗原包括肿瘤病毒抗原和新抗原（NeoAg），具有肿瘤特异性，如图2所示。NeoAg来自非同义突变，可能与功能相关。事实上，“驱动”突变赋予细胞生长优势并且是克隆选择的，与之相反，“乘客”突变不影响复制速度，因此不易受克隆选择的影响[36,37]。过去的CV试验优先选择靶向TAA而非NeoAg，因为后者更难识别[33]。然而，由于TAA是非突变蛋白，利用T细胞库的免疫应答会受到中枢/外周免疫耐受的影响[22]。
相比之下，I/II期临床试验表明，针对NeoAg的免疫应答不受中枢或外周免疫耐受的影响，并具有良好的不良反应谱[38-41]。在过去几年里，更快、更便宜的二代测序（next-generation sequencing，NGS）技术和更精准的生物信息学预测工具促使靶向肿瘤特异性NeoAg的个体化CV进入临床试验，已经获得了有前景的早期临床数据[42]。
图2. 肿瘤疫苗的靶标分为两大类：肿瘤相关抗原（TAA）和肿瘤特异性抗原（TSA）。
TAA是在肿瘤细胞中优先或异常表达的自身抗原，但也可能在正常细胞中出现一定程度表达。与TAA以高亲和力结合的T细胞通常会因中枢和外周耐受机制而从免疫系统中清除。TSA，包括肿瘤病毒抗原和新抗原，具有肿瘤特异性。因此，由于缺乏中枢耐受性，通常具有高度免疫原性。与致癌病毒相关的TSA已在病毒诱导的癌症中得到鉴定，如人类乳头瘤病毒（HPV）相关的宫颈癌、乙型肝炎病毒相关的肝细胞癌和人类疱疹病毒8相关的卡波西肉瘤。肿瘤新抗原是癌变过程中体细胞突变的产物。由致癌驱动基因突变编码的NeoAg可能在不同患者和肿瘤类型中普遍存在，因此它们被称为共有的NeoAg。然而，大多数NeoAg是个体患者的肿瘤所特有的（私有NeoAg）。迄今为止，通过将肿瘤测序与MHC结合表位预测相结合，在单个患者水平上定制肿瘤NeoAg选择成为可能[27]。肿瘤特异性：“最佳”（抗原仅存在于癌细胞），“良好”（抗原优先在癌细胞中表达），或“可变”（抗原过度表达/与正常组织共享）。中枢耐受性：“高”（在正常组织中生理表达的抗原），“低”（存在中枢耐受性但抗原仅限于免疫豁免部位），或“无”（无免疫耐受性证据）[18,22]。
肿瘤异质性
肿瘤不是单一的生物实体，而是在治疗、免疫、代谢和肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）等多种内外压力下不断演化[43,44]。重要的是，肿瘤内异质性（intratumor heterogeneity，ITH）高的肿瘤与较差的预后相关[45-50]。遗传和/或非遗传机制衍生了不同类型的ITH，即：空间、时间、免疫学和行为学ITH[43]。作为治疗耐药的主要决定因素，为更好地指导治疗策略，ITH应该是一个需要考虑的基本方面[44,51]。理论上，减少ITH的一种方法是在肿瘤负荷低的患者和前线治疗时进行CV试验[52]。与免疫检查点阻滞剂（immune checkpoint blockers，ICBs）相似，CV在未接受过治疗的患者中可能引起更强的免疫应答[53,54]。此外，一个更大胆和有前景的提议是使用CV进行癌症的免疫预防，特别是在患有癌前病变的个体中[55,56]。
重要的是，与其他平台相比，基于基因的疫苗通过引发针对不同表位的抗原特异性免疫应答，有可能更好地靶向ITH[57,58]。这可以通过在每次接种的疫苗中插入编码不同NeoAg的序列来实现[57-59]。此外，随着时间推移肿瘤演化，基于基因的平台可能允许无限次的疫苗接种[60]。在这种情况下，免疫显性的出现（即免疫反应优先聚焦于未知蛋白质可能表位的一个片段）可通过插入编码不同NeoAg的多个序列来减少ITH对疗效的影响，这种现象的最终出现还需要被准确评估[61,62]。
免疫调节：从“冷”TME到“热”TME
减弱CV疗效的一个主要因素是免疫逃逸机制，尤其是在实体瘤中[63]。公认的机制包括炎性肿瘤中的T细胞耗竭，免疫豁免型肿瘤中T细胞浸润的缺乏，以及免疫荒漠型肿瘤中抗原呈递过程缺陷[64]。最近，已经研发出了一些揭示TME复杂性和异质性的新技术，例如质谱流式细胞技术和单细胞组学（即：表观基因组学、转录组学、代谢组学、蛋白质组学）[65,66]。然而，在这种情况下，TME中给定细胞的空间定位通常在样本制备和测序过程中丢失[67]。因此，开发新的基于系统的同步单细胞分析与空间微结构信息相结合的方法仍是一个主要的技术挑战[68-70]。将“冷”TME转化为“热”TME和提高抗肿瘤免疫力的潜在策略总结在图3中[71-74]。
值得注意的是，肿瘤细胞与其TME之间的相互作用可以破坏正常组织的稳态，将TME转变为促进转移的状态。此外，与原发肿瘤部位相比，生长在不同器官的转移性肿瘤可能由显著不同的免疫浸润组成，从而引起不同的免疫治疗的反应[75]。例如，患者匹配的原发性与转移性乳腺癌之间免疫浸润的比较证明，转移部位肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAM）的含量较高，表明TAM可作为转移性乳腺癌的潜在治疗靶点[76]。
此外，许多研究都聚焦于肿瘤代谢如何导致免疫抑制型TME状态[77]。目前认为的TME代谢紊乱，例如，低pH、缺氧、有氧糖酵解、脂肪酸生物合成、乳酸和犬尿氨酸的积累以及葡萄糖、谷氨酰胺和色氨酸的缺乏[78]。在临床前模型中已经针对此类代谢改变进行了探索性研究，而人体转化试验主要研究了抑制吲哚胺-2,3-双加氧酶（indoleamine-2,3-dioxygenase，IDO）的作用[79]。IDO是一种限速酶，在干扰素-γ的作用下表达上调，分解色氨酸，减弱T细胞应答[80]。IDO抑制剂作为单一药物使用时的疗效有限，因此许多临床试验正在研究与ICB或CV的联合使用[81,82]。
癌症-免疫相互作用的另一个关键决定因素是同时使用具有内在TME调节（TME modulator，TMEm）功能的药物[83]。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂是其中一个例子，它与改善的抗原呈递过程和促炎细胞因子分泌有关，最终通过PD-L1上调促进免疫逃逸[84]。为了充分揭示不同药物的调节免疫效应，其TMEm功能需要在疾病特异性临床前模型中进行测试和验证[85]。例如，在胶质母细胞瘤和胰腺导管腺癌小鼠模型中激活的CD73-腺苷轴近来被认为是一个关键可成药的免疫调节途径，促进了临床试验的开展（如ARC-8，NCT04104672）[86]。
最后，最近的研究表明肠道微生物组在调节免疫反应方面发挥了关键作用，也影响了对ICB治疗的反应。例如，在临床前模型中发现共生解肝素普氏菌（Prevotella heparinolytica）可促进产白介素17（interleukin-17，IL-17）的细胞，加速骨髓瘤进展[88]。此外，在接受ICB治疗的黑色素瘤患者中，厚壁菌门和粪杆菌属的肠道定植与临床反应率的提高和结肠炎有关[89]。同样，微生物群组成被认为会影响NeoAg CV的抗肿瘤效果[90]。在药理生物学领域，最近有人提出在抗PD-1治疗时补充双歧杆菌可抑制小鼠乳腺癌模型的肿瘤生长[91]。重要的是，需要在不同肿瘤亚型中评估微生物组的影响，因为其影响可能存在不同。
图3. 将“冷”TME转化为“热”TME的潜在策略。
（A）靶向TME内的细胞代谢和某些代谢物，以减少免疫抑制性调节性T细胞（Tregs）、髓源性抑制性细胞（MDSCs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），或生成具有更好线粒体活性的代谢合适的T细胞来防御肿瘤。图片说明：0免疫细胞；^间质细胞；*癌细胞。（B）靶向表观遗传调节剂，以促进肿瘤细胞的免疫原性，或重新培养TAM、MDSC或Treg以支持T细胞效应器功能[71]。（C）通过STING激动剂的刺激或促进交叉呈递的DCs诱导先天免疫传感系统的活化，以促进肿瘤抗原特异性T细胞在TME内的运输或功能。（D）通过OV或纳米颗粒传递关键免疫调节因子以创造炎性TME[71,72]。在这方面，OV值得特别提及，因为OV能够进行肿瘤特异性复制，从而提供治疗机会[72]。简而言之，OV是天然存在的或基因工程创造的病毒物种，能够选择地杀死癌细胞而不损害正常组织[72]。他们的作用机制是多模式的，因为在原发性/获得的肿瘤中注射OV会诱导肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡（ICD），促进炎性TME的形成。事实上，OV加强自然杀伤（NK）细胞和T细胞的免疫反应，最终促进OV感染癌细胞的裂解。此外，抗病毒先天免疫，如I型干扰素和干扰素刺激基因（ISG）的激活，促进TME内损伤和病原体相关分子模式的释放、病毒/肿瘤抗原的暴露，以及TAMs向抗肿瘤M1表型的极化TME[73,74]。OV介导的免疫检查点（即程序性死亡配体1，PD-L1和程序性死亡配体2，PD-L2）上调，为OV与ICB的联合免疫治疗提供了理论基础。CCL28：趋化因子（C-C基序）配体28；DC：树突状细胞；HAT：组蛋白乙酰转移酶；STING：干扰素基因刺激剂；IFN：干扰素；IL：白细胞介素；ILC1/2：固有淋巴细胞1/2；KDM：组蛋白赖氨酸脱甲基酶；lncRNA：长链非编码核糖核酸；LPS：内毒素；M1：经典活化巨噬细胞；M2：替代性活化巨噬细胞；MDSC：骨髓源性抑制细胞；miRNA：microRNA；N1：抗肿瘤中性粒细胞；N2：促肿瘤中性粒细胞；NK：自然杀伤细胞；OV：溶瘤病毒；RNA Pol II：RNA聚合酶II；SAM：S-腺苷甲硫氨酸；STING：干扰素刺激基因；TAM：肿瘤相关巨噬细胞；TF：转录因子；TGF-β：转化生长因子-β；Th：辅助性T细胞；TLR：Toll样受体；TNF：肿瘤坏死因子；Treg：调节性T细胞。
技术进步和缺陷
相关平台的改进
重大的技术改进主要影响了基于基因和病毒的平台。在过去，基于基因的疫苗一直落后于其他的疫苗，主要是由于缺乏安全数据和大规模生产经验、早期制剂免疫原性低、不稳定和吸收/特异性差等[92]。然而，近年来，他们的应用蓬勃发展，主要是由于三个主要技术领域的进步：结构优化、新型生产系统和精确的表位预测工具[93-96]。信使RNA（mRNA）的生产已标准化，制造过程更简单，无需细胞培养或病毒载体生产[97]。此外，正在研发的基于mRNA的平台允许快速调整序列，以应对新出现的耐药性突变[92]。最后，基于基因的平台的另一个优势是，这种平台不需要外源的免疫原性物质，可能允许无限次的给药/加强注射[92]。关于RNA结构优化，最近的技术改进针对避免有害的免疫激活以及提高安全性、生物分布和免疫原性[98]。已取得的重大突破包括，通过序列优化提高转录能力和体内稳定性，通过良好生产实践等级的纯化系统避免有毒残留物，以及插入具有更高翻译能力和更低免疫原性（通过Toll样受体7回避）的修饰核苷酸，例如N1-甲基-假尿苷（1mΨ）[98]。这些修改可能会扩大基于RNA疫苗的临床适应证，例如，最近一种非炎症性、基于1mΨ的疫苗结构设计在自身免疫性脑炎的实验性临床前模型中显示出疾病保护作用[99]。
此外，mRNA序列不仅可用于编码肿瘤特异性抗原，还可用于编码免疫调节剂（即：细胞因子、配体）、单克隆/双特异性抗体、小的干扰RNA、CART结构或组合方案[93]。事实上，目前有几个I/II期试验正在测试这些方案[93]。例如，mRNA-2752，一种装载OX40配体（OX40L，也称为肿瘤坏死因子超家族成员4配体）、IL-23和IL-36γ的脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle，LNP），与德瓦鲁单抗（durvalumab）的联用在几种恶性肿瘤中进行试验，并显示出可接受的安全性和促炎细胞因子释放的作用，并在一些病例中观察到肿瘤退缩（NCT03739931）[100]。
与此同时，最近病毒载体疫苗领域也取得了进展[101]，病毒载体疫苗通常使用活的或非复制的载体[102]。主要创新包括引入不同的病毒载体，例如腺病毒（adenoviruses，Ad）[即非人类灵长类动物（non-human primate，NHP）]、细小病毒[即腺相关病毒（adeno-associated viruses，AAV）]和痘病毒[即改良安卡拉病毒（Modified Vaccinia Ankara，MVA）][103]。这些平台具有显著的多功能性，携带用于抗原表达的遗传信息，并诱导有效的T细胞应答[104,105]。对这些病毒载体的一个主要限制是既往感染后的免疫反应发生率较高，可能导致多次接种疫苗受限，进而降低总体疗效[102]。为了克服这一点，基于两种不同的免疫非交叉反应病毒的首剂/加强方案（异源首剂/加强）已在人体显示出有前景的结果[106-108]。或者，也可以使用预先存在免疫反应发生率低的血清型[109]。此外，基于细胞培养系统的复杂制造流程和残留病毒复制的可能性仍然是研究和技术发展需改进的探索领域[102,110]。
此外，基于病毒的方法也适用于OV[72]。由于具有在癌细胞内复制的天然能力，OV既往已被用作原位疫苗接种剂，以诱导针对多种不可预测的抗原表位的免疫应答[72]。值得一提的是，Talimogene laherparepvec（T-VEC）是目前唯一获得监管批准的OV[111]。随后，研究人员试图用免疫调节剂来加强OV，将其与免疫刺激剂偶联和/或诱发抗原特异性反应[112,115,116]。在儿童高级别胶质瘤中，单纯疱疹病毒1 G207可引起显著疗效和肿瘤免疫浸润[113]。此外，临床前模型中，接种基于腺病毒的疫苗后使用转基因马拉巴病毒（MR1）能提高免疫反应，为在人体进行Ad:MR1首剂-加强组合的试验提供了理论依据（NCT02285816和NCT02879760）[114]。最后，利用目标肽包裹病毒粒子是通过OV诱发抗原特异性应答的策略，包括利用静电力（即带负电荷的病毒粒子和带正电荷的聚赖氨酸肽）或膜锚定的方法[72,112]。
新型运载工具
新型复合物已经进入临床试验，特别是针对基于RNA的平台，如鱼精蛋白复合物、脂质复合物（lipoplexes，LPX）或脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles，LNP）[58,117,118]。其中，LNP作为纳米医学的一项重大进步，在COVID-19疫苗的研发中得以应用。尤其是以LNP作为刺突蛋白编码mRNA载体的BNT162b2和mRNA-1273，目前正在全球疫苗接种计划中使用[23,24]。这是这种基因疫苗首次在一般人群以及肿瘤患者、孕妇和老年人等特殊人群中显示出非常好的安全性[26,119,120]。值得注意的是，在完成第二次疫苗接种后6个月，抗体仍持续存在[25,161]。简而言之，LNP保护RNA序列不被降解，并允许严格的时空控制。此外，通过进一步修饰LNP的脂质/部分组成可以促进细胞/器官特异靶向性和佐剂特性，进一步扩大了基因疫苗的潜在运用范围[97,121]。
生物信息学和新抗原预测工具
NeoAgs不仅可用以间接评估某些肿瘤对ICB治疗有效的可能性，还可用于设计个体化的治疗性CV[122,123]。为此，标准化生物信息学工具已经被研发出来，该工具能够识别和优先考虑可能的肿瘤特异性突变[123]。然而，由于HLA限制性/免疫优势，并非所有突变产生的新表位都会被免疫系统识别[59,62]。因此，HLA分型也是预测潜在免疫原性表位所必需的[42]。HLA I型结合表位是通过肽结合亲和力数据训练的算法来进行预测的[42,126]。为提高准确性，此类算法也已在特异性单等位基因HLA表达细胞系中出现的肽的质谱（MS）数据中进行了测试[123-125,127,128]。除MS外，高通量检测突变相关表位的方法也已成功应用，如质谱流式细胞技术和T细胞受体克隆分型[42]。此外，大数据分析和人工智能的最新进展有助于提高新表位预测能力[129-132]。特别是，为建立Ag提呈的计算模型，深度学习方法已应用于各种人类肿瘤（即NetMHCpan、NetMHCllpan）的大型HLA肽和基因组数据集[129]。此外，大规模癌症蛋白质组学数据共享工作，例如临床蛋白质组学肿瘤分析联盟、肿瘤新抗原选择联盟和健康人体组织的HLA图谱数据库，将有助于筛选出可靶向肿瘤NeoAg[133,134]。
目前，靶向NeoAg疗法设计方面存在一些难点。例如，在大量推定的NeoAg中，只有一小部分最终被验证、呈现出有效性或显示出免疫原性[135]。事实上，预测工具对主要组织相容性复合物-I（major histocompatibility complex-I，MHC-I）比MHC-II更具特异性，这可能是因为MHC-II的序列更长且末端开放[42]。此外，更多的证据表明，许多肿瘤特异性抗原表位可能来自非翻译序列，而大多数计算工具未针对这些序列进行优化[136]。最后，需要进一步研究以提高对影响NeoAg表达、呈递和免疫原性的因素的认识[42]。
让癌症疫苗进入临床
基于基因的CV
由于大量的I/II期试验仅入组了少量的患者并且设置了不同的主要研究终点，以及不断革新的技术，基于核苷的CV临床结果存在差异[92]。
总的来说，基于基因的疫苗约占临床前疫苗研发的22%（37/166）以及临床疫苗研发的37%（10/27）。重要的是，其中两种疫苗获得FDA批准用于COVID-19[137,138]。在此背景下，两项里程碑式临床试验首次提供了靶向TAA和NeoAg作为肿瘤治疗方法的有效性证据[40,135]。的确，在I期LipoMERIT试验（NCT02410733）中，89名ICB治疗后的晚期黑色素瘤患者接受了针对多达四种TAA的基于mRNA的CV治疗[139]。惊人的是，在接种疫苗后观察到单独Th1细胞的多克隆T细胞应答，以及联合抗PD-1在ICB治疗后患者中的协同作用，最终引起了持久的应答率（联合治疗组为35%）。值得注意的是，经过优化的RNA在未成熟树突状细胞中实现了最高表达[96]，并且脂质体递送系统通过TLR-7介导的I型干扰素反应，促进T细胞扩增[140]。I期个体化癌症免疫疗法（IVAC）MUTANOME试验（NCT02035956）在13名晚期黑色素瘤患者中测试了针对2个TAA和多达10个NeoAgs的基于RNA的平台，结果显示接种疫苗的患者中出现T细胞应答，转移事件累积概率降低[40]。值得注意的是，所有患者均检测到CD4和CD8多克隆T细胞应答，并显示出与ICB的协同作用[40]。
总之，这些试验提供了关于多线治疗后、高肿瘤负荷患者群体的证据，凸显了基于基因的平台的潜力及其与传统免疫疗法的协同作用。
病毒载体CV
多种病毒载体已在CV临床研究中进行了评估[141]。例如，近来一种大猩猩腺病毒（gorilla adenovirus，GAd）衍生的基于NeoAg的CV在临床前肿瘤模型中显示出与ICB的协同作用，并达到了疾病根治的效果[142,143]。重要的是，病毒载体可以装载多种目标Ag，例如在转移性去势抵抗性前列腺癌患者中的前列腺特异性抗原/黏蛋白-1/brachyury（NCT03481816），或病毒载体装载调节性免疫调节剂表达，例如在神经胶质瘤临床前模型中用于IL-12递送的基因开关[144,145]。此外，两种用于递送NeoAg CV：黑猩猩（ChAd68）和GAd20的NHP Ad载体正在临床研发中。初步结果显示，在晚期肿瘤患者，使用ChAd68疫苗接种后，CD8 T细胞对多种NeoAgs具有强大且一致的诱导作用（Granite，NCT03639714，NCT03953235）。
上述提到的抗载体免疫诱导已通过异源性首剂/加强克服。这些试验比用单个病毒载体重复接种疫苗能引起更高的免疫反应[146]。自扩增RNA和MVA技术目前都在临床研究中被用于增强NHP的Ad载体 (NCT03639714)。在这方面，针对MSI-H肿瘤的基于Neo-Ag的疫苗使用两种载体（GAd20和MVA）的NHP/MVA首剂/加强方案正在接受评估。相反，Nous-209疫苗是在MSI-H肿瘤患者中同时利用编码209个共享NeoAg肽的四种病毒的载体[146]。
针对中枢神经系统的腺病毒载体疫苗的试验也正在进行中。在此背景下，I期剂量递增研究中对37名复发性高级别胶质瘤患者使用DNX-2401（Delta-24-RGD），结果显示20%患者存活时间>3年[147]。总体而言，由于新病毒物种的开发和其他疫苗接种方法的创新策略，基于病毒的CV的整个领域正在进步，促进了其在肿瘤领域的应用。
基于肽的CV
从历史上看，迄今为止在临床中试验的大多数基于肽的CV显示出不同的免疫原性和临床活性[148]。该领域的两个主要的进展包括新佐剂的引入以及合成长肽（synthetic long peptides，SLPs）的应用[149-151]。与短肽不同，SLP不直接与MHCI类分子结合；实际上，他们需要Ag呈递处理才能呈递给具有适当的免疫刺激共受体的细胞毒性T淋巴细胞[152]。此外，SLPs还允许多表位靶向，如TAS0314，一个由四种TAA组成的肽，来自于表达SART293-101的黑色素瘤临床前模型的T细胞识别鳞状细胞癌抗原（SART）2和SART3蛋白[153]。采用这种方案的其他配方目前正在评估中[154]。
此外，基于肽的CV配方还可以针对患者特异性NeoAg。在此之中，NeoVax是最先进的CV产品之一，NeoVax由多达20种不同的SLP和免疫刺激佐剂poly-ICLC（一种合成的双链RNA病毒模拟物，作为TLR3的激动剂）[38]。在晚期黑色素瘤和胶质母细胞瘤的临床试验中均显示疫苗接种后出现了多功能、特异性的Th1单独应答（NCT01970358和NCT02287428）[38,155]。在黑色素瘤试验中，6例患者中有4例在接种疫苗后25个月内没有出现复发，而2例复发患者在接受ICB治疗后肿瘤完全消退[38]。这些研究凸显了这种基于肽的CV配方的潜力，目前该类配方与其他免疫治疗联合的研究也正在进行中（NCT02950766和NCT03929029）[42]。此外，Ib期研究NT-002也是非常有前景的，该研究评估了个体化NeoAg CV，NEO-PV-01，该疫苗是由生物信息学分析预测选择出的多达20个NeoAg组成，用于一线联合卡铂、培美曲塞和帕博利珠单抗治疗晚期非鳞状NSCLC（NCT03380871）[156-158]。该作者报道了Ag特异性和持久的免疫反应（长达1年），约55%的疫苗肽产生可评估的免疫应答。值得注意的是，意向治疗人群和疫苗接种人群的总体反应率分别为37%和57%[157]。
总体而言，关于基于肽的CV制剂，仍需要在佐剂领域以及理想抗原靶点进行探索研究，以进一步提高免疫原性并最终达到提高临床疗效的目的。
生物技术和产业前景
CV开发工作的一个关键方面是能够做出早期和客观治疗选择的能力，以选择理想的候选药物、特定的平台、最终的组合药物和疫苗接种计划[159]。
对于基于RNA的CV，为提高其疗效，仍然需要缜密地评估各个不同方面。一个是其设计，因为LNP：mRNA质量比可以调整（从10：1到30：1），这意味着，例如，在给定剂量下，大量LNP可作为多抗原候选[42,98]。此外，非复制mRNA和自我扩增mRNA疫苗序列之间的安全性和免疫原性差异在很大程度上是未知的，并且可能对自我完善现有研发方案中序列优化产生影响[97]。此外，由于一些细胞内免疫传感器是由RNA激活的，因此早期临床试验需要精确捕获不同mRNA疫苗制剂的炎症成分，以便优化效益（免疫原性、功效），同时降低风险（安全性）[160]。在这方面，安全性和耐受性可能会限制多抗原治疗方案，因此临床前研究对研发至关重要。最后，人体重复使用mRNA疫苗的数据是有限的[159]。随着整个领域从人体试验和当前COVID-19疫苗接种项目中积累了更多数据，潜在的长期安全性和免疫原性问题将需要准确地收集并批判性地讨论[118,138]。
考虑到生物技术和产业影响，基于病毒的CV面临着不同的问题。重要的是，制造流程更加复杂，需要耗时费力的细胞培养方法，要求进行复杂的纯化过程和微生物污染的限制[162]。此外，复制缺陷病毒需要仔细通过临床前和临床验证其复制能力，以及在特殊的亚组人群（如免疫缺陷个体）中引起的全身性疾病表现[163]。此外，对于已经在一些严重急性呼吸综合征冠状病毒或呼吸道合胞病毒疫苗的临床前模型中描述的疫苗相关疾病的增强效应，始终需要考虑[164,165]。此外，在临床实践中引入新病毒时，有关毒性的及时报告必须由监管机构进行仔细监察[166]。
鉴于从测序研究中获得的某种突变，在制定疫苗接种策略时要考虑的关键方面总结在图4中。例如，肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）高的肿瘤患者应该从针对不同预测新表位的多轮个体化疫苗接种中获益更多，并且疫苗可能与ICB或TME改变药物联合使用[92]。相反，在低TMB肿瘤中，现成疫苗接种策略应该是预防性地针对慢性伴随治疗产生耐药性的病毒相关的表位或突变，或治疗性地针对已知的驱动突变。总体而言，由于不断的技术进步和数据获取，这些考量因素必须不断更新和重新评估。
图4. 建议的基于抗原（Ag）的癌症疫苗接种策略
不同的突变/生物学依赖性可能指导各种疫苗接种策略和联合方案。NeoAg，新抗原；NGS，二代测序；TAA，肿瘤相关抗原；TMB，肿瘤突变负荷；TME，肿瘤微环境。
未来展望
由于大多数CV临床试验都是小规模的，因此需要对来自这些临床试验的数据进行标准化，以便于进行比较并建立有关免疫原性、生物标志物和疗效的大规模参考数据集[18]。由此，患者分层可以识别可能从CV方案中获益的亚组[167]。与此同时，尝试对正在进行ICB治疗患者中发现的预测生物标志物的转化研究也可能有助于识别最有可能对CV有应答的患者。例如，最近一项转录组学和来自超过1000名接受ICB治疗的各种恶性肿瘤患者的临床数据的荟萃分析发现，克隆的TMB、C-X-C基序趋化因子配体（CXCL）9/CXCL13表达、细胞周期蛋白D1扩增和TNF受体相关因子2丢失可预测ICB反应[168]。
另一个关注点是将疫苗接种策略与肿瘤生物学/遗传学相匹配。事实上，CV既可以制成即用型，即现成药物，或作为基于测序数据的个体化产品[18,169]。癌症生物学和源自多瘤种的大型纵向测序研究的数据必须在不同临床环境下指导不同的疫苗接种策略[168]。例如，根据测序数据定制的疫苗接种策略应该最适用于ICB正向疗效预测生物标志物阳性的患者[168]。相反地，高致癌基因依赖的肿瘤以驱动突变为特征，这些突变位于特定位点并且很少有频发的基因改变[18]。理论上，这些肿瘤可能在（新）辅助治疗中可以受益于针对此类频发驱动突变的疫苗接种策略，使用基于组织学信息的即用型、现成的CV产品。在这方面，2019年，莫德纳和默克公司开展了一项I期临床研究，旨在研究靶向NSCLC、胰腺癌和结直肠癌中四种最常见的KRAS突变的基于mRNA的疫苗联合或不联合帕博利珠单抗（NCT0394876）。重要的是，现成CV产品也可用于接受靶向或内分泌慢性治疗患者的预防，以避免导致耐药的频发突变，遗传性肿瘤综合征（如家族性腺瘤性息肉病、Lynch综合征）患者也同样适用[170-172]。此外，驱动突变及其耐药性突变，可能不是致癌基因驱动肿瘤的唯一靶点。事实上，致癌通路通常与其他突变蛋白协同促进疾病进展[173,174]。例如，胰腺导管腺癌的临床模型中，KRAS利用TP53突变促进肿瘤的生长[37]。
如前所述，联合药物的选择必须考虑肿瘤生物学和TME特异性紊乱，以及使用这些药物的临床背景。因为任何药物联合都以可能增加副作用为代价，并且毒性/效益比存在个体差异，从肿瘤早期到晚期也不同。例如，在早期阶段，联合方案应以增加CV免疫原性并促进T细胞亚群形成和持久记忆为目标。相反，在转移的情况下，联合治疗应在中短期内实现疾病控制，使CV刺激T细胞特异性免疫和/或重新激活ICB驱动的应答。
值得注意的是，越来越多的证据表明，在几种恶性肿瘤循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）阳性患者中，ICB治疗获益更明显，ctDNA血清转阴率具有良好的预后作用[175,176]。该生物标志物最终预后/预测作用的综合数据可能指导使用ctDNA血清转阴率作为（新）辅助CV临床试验的主要终点，和长期生存（即无疾病进展时间，OS）一起作为支持最终监管批准数据。
最后，为了在癌症疫苗接种领域继续保持积极势头，还需要在研究和技术、临床使用情况、试验可比性和全球准备四个方面进一步加强（图5）。
图5. 加强未来癌症疫苗项目适用性和提高临床疗效的关键问题
癌症疫苗学发展的主要领域包括技术进步的快速引入，鉴别可以从CV项目中受益的明确人群、努力实现不同临床试验的可比性，以及建立能够维持可能的需求和供应链的全球化劳动力队伍。COSMIC，癌症体细胞突变目录；LNP，脂质纳米颗粒；LPX，脂质复合物；TME，肿瘤微环境。
结论
未达到最佳的临床试验设计、使用CV单药治疗、较弱的Ag，以及入组晚期、多线治疗后的患者，是导致迄今为止临床试验结果较差的部分原因[177]。尽管如此，肿瘤学和疫苗学都取得了巨大进步[27-29]。
首先，前所未有地深入研究了癌症遗传学的特征，包括治疗耐药的遗传决定因素，以及在未来的临床试验中引入新的免疫疗法或改变TME的药物联合CVs，拓宽了TAA或NeoAg靶点的范围[178]。此外，随着肿瘤突变与HLA测序人群库（如IPD-IMGT/HLA数据库）的日益普及，生物信息学预测工具正变得更加完善[179-181]。其次，疫苗学领域的技术正在进步，特别是在配方（基于基因、病毒、多肽）和递送系统方面，这些进步使在COVID-19大流行期间及时引入了有效疫苗[21]。在这种情况下，应对COVID-19的研究和创新努力提供了大量证据，证明这些疫苗平台技术的良好安全性和免疫原性，并指出CV需要联合干预抑制性TME的治疗。这种动力反过来可能会加速采用新技术的CV的研发，这些新技术在早期I期试验中显示出有前景但不成熟的疗效[42,98]。
重要的是，此类药物监管批准的预设理想终点的选择仍然是一个争论的问题，正如应该根据基于平台的方法还是单一疫苗产品来考虑安全性。出于这些原因，仍需按照经典的I-III期研究计划进行测试。
总体而言，人们越来越乐观地认为，技术进步、全球疫苗接种积累的数据、强化的生产过程，以及正在进行的II/III期试验的临床结果将阐明CV在随后几年在癌症治疗中的最终地位。
参考文献（略）
主任医师
北京大学肿瘤医院消化肿瘤内科
CSCO青年专家委员会常委
中国抗癌协会大肠癌专委会 内科学组/遗传学组委员
北京癌症防治学会 结直肠癌专委会常委
Annals of Oncology中文版 编委
北京大学肿瘤医院消化肿瘤内科
北京大学医学部博士研究生在读
北京大学肿瘤医院消化内科 住院医师
北京大学肿瘤医院消化肿瘤内科
北京大学肿瘤医院消化肿瘤内科博士研究生在读
排版编辑：lizhi
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