引言：手术切除是I期非小细胞肺癌（Non-small-cell lung cancer, NSCLC）患者的标准治疗方法，然而术后发生复发转移导致患者预后不佳。对于I期NSCLC患者，目前尚无有效的预后生物标志物和围术期治疗方法。因此，更好的了解NSCLC基因组改变和肿瘤免疫微环境特征，可能会为I期NSCLC 围术期治疗找到新途径。
近日，针对该备受关注的领域，中南大学湘雅二医院肿瘤中心吴芳副教授联合胸部肿瘤MDT团队在《Translational Lung Cancer Research》（JCR1区， IF=6.498）发表题为“A prediction model integrated genomic alterations and immune signatures of tumor immune microenvironment for early recurrence of stage I NSCLC after curative resection”的原创性研究论文。湘雅二医院肿瘤中心吴芳副教授为通讯作者，湘雅二医院肿瘤中心胡春宏教授和舒龙博士为共同第一作者。湘雅二医院胸部肿瘤MDT团队刘先领教授、喻风雷教授、范松青教授、刘文亮教授、陈晨副教授、梁青春副教授等专家共同参与。该研究旨在开发一种NSCLC复发相关基因组变异和免疫特征的模型来预测术后早期复发风险，并为围手术期的治疗研究提供依据（图1）。
图1：论文发表在线封面
肺癌是世界上发病率第二高、死亡率最高的恶性肿瘤。NSCLC占肺癌的80-85%。随着低剂量计算机断层扫描筛查的增加，I期NSCLC的患病率也在增加。手术切除仍然是这些患者的标准治疗方法。然而，由于局部或远处复发，预后仍然不理想。近年来，NSCLC围手术期靶向治疗和免疫治疗取得了突破性进展，但很少有研究纳入I期患者。多项III期临床试验表明，围手术期靶向治疗和免疫治疗可能会改善IB期NSCLC患者的预后，但IB期患者的获益不如II/IIIA期患者。了解基因组改变和免疫微环境的作用可能突出开发I期NSCLC围手术期治疗的潜在新途径。基因组改变，例如体细胞突变和拷贝数变异，可能是早期NSCLC复发的重要因素。据报道，驱动基因突变与I期NSCLC手术后较高的复发风险相关。有研究还检查了肿瘤突变负荷（TMB）与早期肺癌复发之间的关联，但研究结果一直存在争议。因此，基因组改变与I期NSCLC患者复发之间的关系需要进一步研究。
程序性细胞死亡配体1（PD-L1）是一种常用的免疫治疗疗效的生物标志物，但其对I期NSCLC的预后价值仍不清楚。一些研究报道了PD-L1表达与I期NSCLC的复发相关，而不同研究的结果差异很大。CD3+、CD8+等肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）在发挥抗肿瘤免疫功能中起着重要作用。根据CD3+和CD8+TIL在肿瘤免疫微环境（TIME）中的密度和分布，有研究提出了结肠癌的“免疫评分”（Immunoscore, IS）分类系统，该系统与疾病复发显著相关，甚至显示出比TNM分类系统更高的预后价值。然而，目前还不清楚IS是否能预测NSCLC的肿瘤复发。
以往的研究已经建立了基于临床病理因素或影像组学特征的I期NSCLC的预后模型。最近，基于肿瘤突变或免疫特征的模型在预测早期NSCLC的肿瘤复发方面也显示出很大的预后价值。然而，很少有研究整合基因突变和免疫特征来构建模型。该团队开发并验证了一个基于130例I期NSCLC复发相关基因组改变和免疫特征的模型来预测术后早期复发。该模型显示出极好的预后价值，可能为未来围手术期的治疗研究提供证据。
该研究共纳入130例三年内复发或五年以上未复发的I期NSCLC患者（本地队列），探究术后复发预测标志物。研究者首先分析了患者临床特征与早期复发的相关性；并对手术组织样本进行全外显子测序（WES），分析了基因突变、拷贝数变异、肿瘤突变负荷 （TMB）以及肿瘤基因突变分数（TMS，依据基因变异分析结果构建）对I期NSCLC早期复发风险的影响；进而评估和分析了PD-L1表达水平、CD3+和CD8+肿瘤浸润淋巴细胞、免疫评分（IS，根据CD3+和CD8+ TILs的密度构建）与早期复发的关系。上述标志物均在TCGA队列（n=97）进行了分析和验证。最后，研究通过logistic回归模型建立了综合的I期NSCLC早期复发风险预测模型，以70%本地队列患者作为训练集建模，剩余30%为验证集，评估模型预测性能。
1、患者的临床特征分析
共纳入130例I期NSCLC患者，其中早期复发组（三年内复发）69例（53.1%），无复发组（五年内无复发）61例（46.9%）。本地队列包括85名男性和45名女性，中位年龄为59.7岁（范围为29至75岁）。99名（76.2%）患者患有肺腺癌（LUAD），31名（23.8%）患者患有鳞状细胞癌（LUSC）。与LUSC相比，LUAD的复发风险更高（P=0.008）。而其他临床特征，包括年龄、性别、吸烟史、肿瘤分化程度、肿瘤部位、胸膜侵犯、支气管侵犯、肿瘤大小和分期等均与早期复发无显著相关性。但在LUAD中，吸烟史与较高的早期复发风险相关（P=0.029），而在LUSC中，所有临床因素与复发风险无关。与本地队列一致，在TCGA数据集中，早期复发也与组织学类型显著相关，而与其他临床特征无关。
2、基因组突变分析
（1）比较本地队列和 TCGA 队列之间的基因组背景
基因组分析显示早期复发组和非复发组中分别有1080个和478个不重叠的突变基因，两组共有150个重叠的突变基因。基于WES检测的结果，在两个队列的前40个突变基因中，只发现了三个共同的常见基因（TP53、AHNAK2和TTN）。由于两个队列之间的一些临床特征不同，研究者通过执行倾向评分匹配（PSM）从TCGA队列中选择具有相同数量（n=74)和相似临床特征的匹配患者，以消除临床特征对基因组改变的影响。但仍然只发现了三个共同基因（TP53、AHNAK2和TTN)。在本地队列中，粘蛋白相关抗原4（MUC4）是最常改变的基因（24%），其次是TP53（23%）。在TCGA队列中，TP53的突变率最高（67%），而只有5%的患者表现出MUC4突变（图2）。
图2 WES从本地队列和TCGA队列中鉴定出I期NSCLC的体细胞突变
（2）单变量分析鉴定和验证复发相关基因突变
通过单变量分析识别和验证复发相关基因突变，该团队分析了突变与复发风险之间的关系。MUC4突变与队列中的早期复发显著相关（P=0.0008）。值得注意的是，所有鉴定的MUC4突变都聚集在外显子2中。EGFR突变与TP53与早期复发的风险也没有相关性。在TCGA队列中，EGFR和TP53与早期复发无关，与本地队列一致，而MUC4突变与TCGA队列中的早期复发无关（图3）。
图3 I期NSCLC复发相关基因突变的鉴定和验证
（3）TMB和早期复发
该团队计算了来自WES数据的74个样本和来自靶向测序小组的14个样本的TMB。早期复发组和非复发组WES的TMB中位数分别为1.25和0.72/Mb。早期复发组TMB较高（P=0.0057）。进一步分析显示，较高的TMB与较高的LUAD和LUSC复发风险相关（分别为P=0.031和0.05）。在TCGA队列中，只有LUAD患者的早期复发与高TMB显著相关（P=0.029），而在NSCLC或LUSC患者中，早期复发与TMB无关（图4）。
图4 本地队列和TCGA队列中TMB与早期复发的关系
（4）基于Lasso回归结果的肿瘤突变评分（TMS）与早期复发显著相关
研究者进行了Lasso回归分析并确定了11个与早期复发相关的基因突变：MUC4、KRTAP10-6、ZFHX4、TCF20、PRDM7、MEOX2、NPIPB5、FAM173B、ACP2、SCN5A、NSRP1。该团队在74个样本中构建了TMS。复发组TMS分布均匀，而非复发组TMS普遍偏低。ROC曲线显示TMS的曲线下面积（AUC值）高于MUC4突变和TMB（AUC值分别为0.869、0.717和0.671；图5）。
图5 Lasso回归选择了早期复发相关的基因突变并构建了TMS
在本地队列中，早期复发组在I期NSCLC、LUAD和LUSC中显示出显着更高的TMS（P<0.0001）。与本地队列一致，来自TGCA队列的LUAD患者早期复发的TMS也较高（P=0.031）。然而，在LUSC和整个队列中，TMS与早期复发无关（分别为P=0.07和0.87；图6）
图6 本地队列和 TCGA 队列中TMS与早期复发之间的关系
3、免疫特征分析，IS与NSCLC早期复发风险显著负相关
该团队评估了肿瘤中心（CT）以及浸润边缘（IM）的CD3+和CD8+TILs水平。非复发组的肿瘤显示出更高密度的CD3-CT、CD3-IM、CD8-CT和CD8-IM+TILs（分别为P=0.0202、0.0025、0.0170和0.0392）。早期复发组的PD-L1表达相似（肿瘤比例评分TPS为P=0.8727，综合比例评分CPS为P=0.3578）。该团队进一步根据CD3+和CD8+TILs的密度和浸润位置构建免疫评分IS。IS0和IS4分别在早期复发组和非复发组中占比最大，早期复发组的IS显著降低（P=0.0003）。IS0和IS1患者表现出相似的复发风险。当IS≥2时，复发风险降低并与IS呈负相关。ROC曲线分析表明，IS比单独使用CD3+或CD8+TILs具有更好的预后价值（IS的AUC=0.717；CD3+或CD8+T细胞的所有AUC<0.7；图7）。
图7 本地队列的免疫特征与早期复发风险之间的关系
4、复发风险预测模型的构建和验证
该团队对于多变量分析，纳入了在单变量分析中具有统计学意义的四个因素，包括组织学类型、IS、TMS和TMB。此外，有明确预后意义的肿瘤分期和分级也被纳入。结果显示，低IS（<2）和高TMS（<50%）是I期NSCLC早期复发的独立危险因素（IS P=0.001，TMS P<0.0001）。接下来该团体构建了以下递归模型，将IS和TMS集成到训练队列中，并使用列线图可视化模型。该模型在训练队列及测试队列中都具有很大的区分能力（图8）。
图8 Logistic回归确定了独立预测因子并建立了早期复发的预测模型
5、基因组改变与免疫特征之间的关系
该团队比较了不同IS水平患者的TMS，发现TMS与IS无关。TMS与PD-L1TPS和CPS无相关性。同样发现TMB与IS和PD-L1的表达没有相关性。高TMB组主要表现为高TMS，低TMB组主要表现为低TMS。最后，该团队通过Lasso回归筛选与IS相关的基因突变。共鉴定出14个基因：C16orf3、FH、PER3、MUC20、RNF31、TMEM229A、ELN、IL4I1、ZNF208、ESRRA、ZAN、KALRN、MUC17和OR2V2。其中，C16orf3的相关系数最高。14个IS相关基因突变和11个TMS相关基因突变之间没有交叉（图9）。
图9 基因组改变和免疫特征之间的关系
在TMS 11个基因中，MUC4的预后价值最高。MUC4基因位于3号染色体q29区域，含26个外显子。已有研究报道MUC4过表达与NSCLC的肿瘤进展和转移有关。然而，很少有研究报道MUC4突变在非小细胞肺癌中的作用。MUC4基因突变率在本地队列中为24.3%，与早期复发相关。该团队还注意到MUC4的所有突变位点都聚集在外显子2。有报道称，MUC4基因外显子2的剪接可能通过激活Notch信号通路而诱导胰腺癌细胞的转移。然而，MUC4突变与TCGA队列中的复发无关，可能是因为突变率低。总的来说，MUC4突变可能在I期NSCLC患者肿瘤复发中起重要作用，其具体机制有待进一步研究。除MUC4外，MEOX2还与肿瘤的进展和转移密切相关。
该研究中高TMB与I期NSCLC的早期复发相关，但在多因素分析中，TMB与早期复发无显著差异。为了探讨基因突变与早期复发的关系，该团队分别分析了每个基因，并计算了总的突变状态-TMB。然而，由于样本量有限，单独的分析可能会遗漏一些相关基因。而TMB可能涉及与早期复发无关的基因，这降低了其预后价值。该团队的研究定义了一种新的TMS，一种仅由复发相关基因突变开发的评分系统。TMS较MUC4基因突变和TMB具有更高的预后价值。然而，应该注意的是，MUC4、TMB和TMS在本地和TCGA队列之间都显示出不同的预后价值。研究者还发现两个队列之间几乎没有共同基因。先前的研究报道，东西方NSCLC之间存在显着的种族差异，这可能会削弱TMS在西方NSCLC中的价值。
CD3+和CD8+TILs经常出现在肿瘤免疫微环境（TIME）中，两者都与肿瘤复发有关。该团队的研究结果表明，CT和IM中的高CD3+和CD8+TILs与I期NSCLC早期复发风险降低显着相关。本研究发现，IS是I期NSCLC早期复发的独立预后预测因子。此外，IS比单独使用CD3+和CD8+TILs具有更高的预后价值。因此，使用IS来构建模型，而不是单独使用CD3+或CD8+TILs，这简化并提高了模型的性能。
本研究开发并验证了基于TMS和IS的综合复发模型，这两者都是早期复发的独立预测因子。该模型在训练和测试队列中具有很大的区分度（AUC分别为0.935和0.932）。校准曲线和HL检验表明该模型也有很好的校准。尽管基因组和免疫微环境的改变在肿瘤复发中起着关键作用，但很少有研究将基因突变特征和免疫特征结合起来建立一个综合模型。与之前的模型相比，该团队的模型包含来自基因突变和免疫微环境方面的分子特征，这可能为预测早期复发风险提供可靠的生物标志物，并为围手术期治疗的研究提供证据。该团队还创建了列线图来可视化预测模式，使其更方便临床应用。根据列线图，可以计算I期NSLCC患者手术切除后早期复发的特定风险。
EGFR和PD-L1是靶向治疗和免疫治疗疗效的生物标志物，而它们对I期NSCLC的预后价值尚不清楚。本研究发现在两个队列中，EGFR突变与DFS无关，这与最近的研究一致。该团队也发现PD-L1的表达与I期NSCLC患者的早期复发无关。总之，靶向治疗和免疫治疗常用的生物标志物对I期NSCLC没有预后价值，这可能解释了为什么I期NSCLC不能从围手术期治疗中获益。相比之下，该团队建立的模型可以很好地区分高复发风险的患者。
基因突变可以通过招募或排除免疫细胞渗透来直接影响免疫微环境。该团队发现EGFR和TP53患者在I期NSCLC中与CD3+、CD8+TILs无关。为了进一步探讨基因组和免疫改变之间的关系，研究者鉴定了14个与IS相关的基因突变。在14个IS相关基因中，有些与肿瘤免疫微环境状态密切相关。例如，IL4I1在体内抑制了抗肿瘤T细胞的增殖和激活。PER3是生物钟的核心基因。研究表明，生物钟异常导致T细胞耗竭和免疫抑制分子如PD-L1和CTLA-4的表达上调。RNF31在调节性T细胞（Tregs）中上调，并正向调节FOXP3的稳定性和Treg细胞功能。KALRN突变通过调节癌症中的DNA损伤修复途径来促进抗肿瘤免疫和免疫治疗反应。但很少有研究报道14个IS相关基因中的其余基因与免疫之间的关系。总的来说，14个IS相关基因和11个TMS相关基因之间没有交集。
此外，TMS与IS无关。提示在I期NSCLC中，基因突变与免疫微环境的相关性可能较弱。它们独立地促进了肿瘤的早期复发，这使得构建一个综合的模型比仅仅由基因突变或免疫标志组成的模型更加必要。
总之，本研究通过基因测序和免疫组化，探究了临床特征、基因突变特征和肿瘤免疫特征与I期NSCLC早期术后复发风险之间的关系。研究发现高TMS和低IS是早期复发风险的独立预测因子，并整合TMS和IS构建了具有优异预测性能的早期复发风险预测模型。该研究为早期高复发风险患者的识别提供了一种新的生物标志物，并可能为围手术期治疗的转化研究提供依据。
Chunhong Hu#, Long Shu#, Chen Chen, Songqing Fan, Qingchun Liang, Hongmei Zheng, Yue Pan, Lishu Zhao, Fangwen Zou, Chaoyuan Liu, Wenliang Liu, Feng-Lei Yu, Xianling Liu, Lijuan Liu, Lingling Yang, Yang Shao, Fang Wu*. A prediction model integrated genomic alterations and immune signatures of tumor immune microenvironment for early recurrence of stage I NSCLC after curative resection. Transl Lung Cancer Res. 2022 Jan;11(1):24-42. DOI: 10.21037/tlcr-21-751.
同时多原发肺癌的基因图谱与TMB、PD-L1表达和免疫细胞浸润的关系
中南大学湘雅二医院肿瘤中心
中南大学湘雅二医院科研部 副主任
肿瘤大数据智能化应用湖南省工程研究中心副主任
湖南省优秀青年基金获得者
中华医学会肿瘤学分会青年委员会委员
中国医师协会肿瘤多学科诊疗专委会 委员
国家远程医疗与互联网医学中心肺癌专委会副主委
中国临床肿瘤学会（CSCO）青委会常委
中国临床肿瘤学会（CSCO）非小细胞肺癌专委会委员
湖南省医师协会肿瘤医师分会 常委兼青委会会长
湖南省医学会肿瘤康复与姑息治疗专委会青委会副主委
湖南省医学会肿瘤学专业委员会肺癌学组副组长
第一/通讯作者在Lancet Oncology、JITC等杂志发表论文
2020年美国临床肿瘤学会（ASCO）口头报告
主持国家级、省部级项目十余项
作为PI发起了多项全国多中心临床研究
湘雅二医院胸部肿瘤MDT专家兼秘书
苏公网安备 32059002004080号
