ADJUVANT、ADAUR等临床研究结果的公布，奠定了辅助靶向治疗在可切除EGFR敏感突变患者中的治疗地位。尽管辅助靶向治疗可以给上述患者带来显著无病生存期（DFS）获益，仍有一部分患者在接受辅助靶向治疗短期内出现疾病进展，临床亟需识别真正能从辅助靶向治疗和化疗中获益的人群，在这一背景下，本研究通过大Panel基因检测识别并构建MINERVA评分，真正实现识别从辅助靶向治疗和化疗的获益人群，相关结果发表在最新Nature Communications杂志。
背景及方法
随着ADJUVANT、ADAURA等临床研究结果的公布，奠定了辅助靶向治疗在EGFR敏感突变Ⅱ~ⅢA期NSCLC中的地位。ADJUVANT研究结果显示对于EGFR敏感突变Ⅱ~ⅢA期NSCLC患者，相比于传统辅助化疗，吉非替尼辅助靶向治疗可以给患者带来显著DFS获益。然而，并非所有EGFR敏感突变Ⅱ~ⅢA期患者均可以从吉非替尼辅助靶向治疗中获益，19%~40%患者在接受TKI治疗后仍然会出现复发或转移，这也增加了进一步评估生物标志物的必要性。
本研究通过对ADJUVANT临床研究中171个肿瘤组织进行全面基因组分析，确定了五个预测生物标志物（4/5外显子TP53突变、RB1改变以及NKX2-1、CDK4和MYC拷贝数增加）。随后将上述五个预测生物标志物整合到多基因指数中以评估各种辅助治疗的相对获益 (MINERVA) 评分，根据评分不同将患者分为三个亚组（高度TKI首选，TKI优选组和化疗优选组），这些亚组患者可以分别从辅助吉非替尼或化疗中获得的相对DFS和OS获益。该研究表明，预测性基因组特征可以对可切除EGFR敏感突变NSCLC患者进行分层，并为个性化辅助治疗提供精确指导。
结 果
DFS预测标志物识别
ADJUVANT临床试验中共有171例患者被纳入基因组分析，共有422个癌症相关基因被检测，结果如图1所示。在吉非替尼辅助靶向治疗组和辅助化疗组中，EGFR19外显子缺失突变（49% vs 45%）、21外显子L858R突变（47% vs 53%）和拷贝数增加（17% vs 26%）发生情况相对均衡。与此同时，包括TP53（70% vs 64%）、MCL1（30% vs 16%）、RB1（25% vs 15%）、NKX2-1（两者均为20%）、CDKN2A（16% vs 19%）、PIK3CA (14% vs 17%)、MDM2 (14% vs 9%) 和CTNNB1 (7% vs 18%) 等共突变发生频率相当。值得注意的是，共有76/171 (44%) 名患者携带TP53 DNA结合域错义突变（4-8外显子）。
图1 试验设计流程
本研究采用基于DFS的基因对治疗相互作用的影响测试，以确定用于指导治疗选择的预测性生物标志物。在该测试中，与生物标志物阴性人群相比，生物标志物阳性患者显示出不同的治疗效果。本研究评估了每个突变基因的预测能力，并确定了以下五个具有显著治疗相互作用的预测标志物：RB1改变（相互作用风险比，iHR=4.07，95%CI 1.56~10.58，P=0.004）、NKX2-1拷贝数增加（iHR=0.26，95% CI 0.10~0.68，P=0.006）、CDK4拷贝数增加（iHR=0.14，95% CI，0.03~0.77, P=0.024）、4/5外显子TP53错义突变（iHR=0.33， 95% CI 0.12~0.93, P=0.035）和MYC拷贝数增加(iHR=0.10，95% CI 0.01~0.98, P=0.048)。负iHR提示辅助TKI疗效更优，而正iHR提示辅助化疗相对获益更明显。在调整临床参数后，上述五个预测因子的治疗相互作用仍然显著。作为辅助靶向治疗的负性预测因子，RB1改变包括RB1突变和RB1拷贝数丢失，由于功能相似，并且每个类别样本量相对较小，两者都表现出治疗相互作用的边缘显著性。此外，由于不同外显子TP53错义突变可能表现出不同的预后或预测作用，因此对这些外显子进行了单独分析。与RB1改变类似，4/5外显子TP53错义突变对治疗相互作用显示出边缘意义。进一步分析发现，4/5外显子TP53错义突变（HR=2.69，95% CI 1.60~4.52，P<0.001）和TP53无义突变（HR=1.69，95% CI 1.08~2.65，P=0.022)均与更差的预后显著相关。
MINERVA 评分之PFS
五种生物标志物中的每一种都可以单独预测具有某种特定基因改变患者亚组的治疗结果，在患者水平整合所有突变事件的多基因特征对于估计早期NSCLC患者分子异质性的总体反应至关重要。因此，本研究构建了MINERVA评分，通过将来自五个选定基因的个体治疗相互作用测试的z评分相加，定量评估个体肿瘤及其相应的治疗反应。所有171例患者的最终MINERVA评分范围为-7.09~2.88，较低的评分表示对辅助TKI治疗反应更好。
为了进一步对患者获益进行分层，每个评分背后的基因组构成和最佳生存情况同样被考虑在内。首先，81例 (47.4%) 未携带任何预测基因改变（分数=0）的患者被分在一组。此外，该组中纳入了6例同时具有NKX2-1和RB1改变的患者，他们的评分为0.16。NKX2-1（z评分，-2.72）和RB1（z评分，2.88）是辅助治疗的最强预测因子，但预测结果正好相反，结果如表1所示。为了针对特定治疗获益对患者进行分层，本研究评估了MINERVA评分在±1、±0.5和0的临界值，由于生存差异显著，本研究选择将评分在-0.5~0.5的患者分为三个亚组。在预先分类的人群中，吉非替尼显著延长了中位DFS，并增加了2年DFS率，结果如图2a所示。
表1 不同基因改变对DFS的预测作用
图2 MINERVA评分不同亚组患者DFS结果
值得注意的是，经过MINERVA分类后，三个亚组表现出不同的治疗反应和潜在的分子特征，结果如图2b、c所示。相比于吉非替尼辅助靶向治疗，高度TKI首选治疗组（HTP，N=60，35%，分数≤-0.5）预后明显更优（HR=0.21，95% CI 0.10~0.44)，并且通常表现为NKX2-1、CDK4和MYC拷贝数增加以及4/5外显子TP53错义突变。TKI首选组（TP，N=87，51%，分数-0.5~0.5）在预先分类和ITT人群中显示出DFS改善（HR= 0.61，95% CI 0.35~1.07)。此外，除了NKX2-1拷贝数增加和RB1改变的零星共存，该亚组的特点是缺乏大多数预测性生物标志物，结果如表1所示。对于化疗首选组（CP，N=24，14%，score ≥ 0.5)，RB1改变更为常见，EGFR敏感突变合并RB1改变这一亚组患者从辅助化疗中获益更多，结果如图2c所示。
在TP组中，预分层和ITT人群生存曲线相似，结果如图2a、e所示，相比于辅助化疗，吉非替尼辅助靶向治疗可以给患者带来显著DFS获益。HTP和CP组患者的生存曲线如图 2d、f所示。在HTP中，生存曲线早在6个月时就出现很大差异，辅助吉非替尼组下降缓慢（中位DFS，34.5个月；P<0.001）。相反，VP化疗组生存曲线急剧下降，中位DFS为9.1个月，在36个月时所有患者均复发。吉非替尼的相对获益表现为2年DFS率增加6.4倍 （70.3% vs 11.0%，中位DFS增加25.4个月，结果如图2d所示。在CP组中，生存曲线在18个月时出现差别，吉非替尼组急剧下降，中位PFS仅为19.3个月。同时，70%VP化疗组患者在24个月后继续受益（中位DFS，34.2个月，P=0.041）。辅助VP化疗的优越性体现在2年DFS率增加1.7倍（69.2% vs 41.6%），中位DFS延长14.9个月，结果如图 2f所示。
MINERVA 评分之OS
吉非替尼辅助靶向治疗和VP辅助化疗组共171例患者在OS方面并无显著统计学差异（中位OS，吉非替尼组为76.9个月，VP组为67.1个月；HR=0.87，95% CI 0.57~1.35，P=0.54)（图 3a）。MINERVA 成功地证明OS获益的分层差异，在HTP中，吉非替尼治疗显著延长OS （中位OS，吉非替尼组未达到，VP组为48.7个月；HR=0.43，95% CI 0.21~0.88，P=0.018），生存曲线清晰且在早期即发生分离（图 3b、c）。相反，辅助VP治疗在18个月后显著改善了CP组的OS（中位OS，吉非替尼组为36.4个月，VP组未达到；HR=2.47，95% CI 0.76~8.02，P=0.12）（图 3b、e）。TP中的OS反映了预分类队列的OS，表明辅助靶向治疗和化疗之间并无显著差异（图 3a、d）。同样，分类亚组的2年、3年和5年生存率显示出相似的趋势，HTP和CP组中两种治疗之间的生存差异随着时间的推移而扩大。吉非替尼治疗的HTP组患者和VP治疗的CP组患者的5年OS率分别为67.3%和61.5%，均显著高于总人群中吉非替尼和VP化疗取得的55.7% 和51.5% 的5年生存率。
图3 MINERVA评分不同亚组患者OS结果
MINERVA 评分验证
接下来，本研究采用十倍交叉验证和LOOCV方法来评估MINERVA评分的稳定性。对于每一次交叉验证，根据交互作用P<0.05选择标记子集，然后将其用于构建模拟MINERVA评分以进行内部验证。在HTP和TP亚组中观察到辅助吉非替尼治疗的相对优越临床获益，2年DFS率分别增加3.5倍和1.9倍（图 4a），中位DFS分别增加20和15个月（图 4b）。在生成的100个模拟MINERVA评分中，75%显示出显著的治疗交互作用，P<0.05，而86%显示出交互作用P<0.1（图 4c）。LOOCV方法验证结果显示，HTP组中接受辅助VP治疗与显著降低的DFS和OS密切相关（图 4d，g）。同时，CP组的辅助吉非替尼治疗效果明显较差，均与之前结果一致。
接下来，本研究对具有相似临床背景（EGFR敏感突变，ⅢA~N2 期NSCLC）的独立队列进一步验证了MINERVA评分方法。在纳入29例患者的分析中，显示出一致结果。在HTP组中，辅助靶向治疗PFS明显优于辅助化疗（P=0.039；中位PFS，厄洛替尼治疗组，23.8个月 vs 化疗组，4.5个月）。在TP组、验证队列和整体人群中，厄洛替尼的PFS获益类似。在CP组中，尽管样本量有限，相比于TKI辅助靶向治疗，辅助化疗的中位PFS明显更优（11.8个月 vs 17.7个月）。
图4 MINERVA内部验证结果
结 论
通过对TP53突变、RB1改变以及NKX2-1、CDK4和MYC拷贝数增加5个预测性生物标志物组合的MINERVA)评分，可以将EGFR敏感突变Ⅱ~ⅢA期NSCLC分为高度TKI首选、TKI优选和化疗优选三个不同亚组，精准识别出从辅助化疗和靶向治疗中获益的人群。该研究表明，预测性基因组特征可以对可切除的EGFR敏感突变NSCLC患者进行分层，为未来个性化辅助治疗提供精确指导。
Si-Yang Liu, Hua Bao, Qun Wang, et al. Genomic signatures define three subtypes of EGFR-mutant stage Ⅱ–Ⅲ non-small-cell lung cancer with distinct adjuvant therapy outcomes. Nat Commun. 2021; 12: 6450. Published online 2021 Nov 8. doi: 10.1038/s41467-021-26806-7.
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