近期发表于JITC的综述，聚焦并分析各类过继性细胞疗法（ACT）的机制，围观ACT治疗实体瘤的可能性。
本文要点
ACT制备与机制
ACT分类
· TIL
· TCR-T
· CAR-T
ACT治疗实体瘤挑战
· 靶抗原异质性不稳定和抗原逃逸
· T细胞的迁移和渗透受阻
· 肿瘤微环境免疫抑制
ACT治疗实体瘤突破与前景
正文
免疫检查点抑制剂（ICI）已在黑色素瘤、肺癌、头颈癌等诸多恶性实体瘤治疗领域取得突破，但其原发性和获得性的耐药成为了抗肿瘤治疗的新挑战。效应性质T细胞数量及功能不足、记忆T细胞形成受损等都与ICI耐药密切相关。ACT可通过增加肿瘤组织T细胞的数量、特异性和反应性，克服相关免疫治疗痛点。
【ACT制备与机制】
ACT需要提取患者或供体的T细胞，在实验室中进行培养和/或修饰，再将最终产出的T细胞重新注入患者体内。基于T细胞的体外扩张和改造，ACT能够绕过某些抑制性免疫调节因子，提高T细胞的数量、反应性和特异性。ACT已经在血液肿瘤中获得了积极结果，但其在实体肿瘤中的应用尚处于早期阶段。
【ACT分类】
目前有三种主要的ACT模式，分别为：
肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）
基因工程T细胞受体T细胞（TCR-T）
嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）
TIL治疗通过增强内源性T细胞的异质群体以增强抗肿瘤免疫；
而TCR和CAR-T细胞治疗则针对特定抗原靶点的，对T细胞进行基因工程修饰。
表1. 目前已开展相关临床研究
Ø TIL过继细胞治疗
TIL是指离开血液进入肿瘤的淋巴细胞。作为一种多克隆的异质细胞群，TIL在肿瘤中具有广泛的抗原识别能力。丰富的TIL浸润与肿瘤患者预后良好相关。由于炎性浸润，肿瘤微环境富含Treg细胞（免疫抑制）和髓系抑制细胞而抑制TIL的免疫效应。
TIL治疗策略是通过促进免疫细胞扩增，摆脱微环境的免疫抑制。这一治疗过程包括从切除的肿瘤中获取和分离TIL，在体外扩增，然后再输注回患者体内。
针对黑色素瘤的人体试验显示，TIL过继细胞转移带来高达55%的客观缓解率（ORR），证明TIL疗法能够安全有效地根除肿瘤细胞。
多项临床研究表明，TIL疗法耐受性良好，大部分治疗相关毒性都与淋巴细胞清除化疗和/或IL-2有关。另外，大多数对TIL有反应的患者为既往使用ICI后发生疾病进展，这表明两种治疗之间的机制并不重叠。已有数据表明，使用ICI治疗的癌症患者仍有大量的肿瘤反应性T细胞，但总体反应不佳。因此未来亟待解决的，是如何在这类患者中重新激活TIL效应，而TIL过继细胞疗法也需要评估何时使用、扩增到何种程度疗效最佳。
淋巴细胞清除被认为有助于增强TIL过继细胞的抗肿瘤疗效，一方面需要去除抑制CD8+ T细胞免疫的调节性T细胞，另一方面还需要清除肿瘤微环境中抑制免疫的细胞因子，以保障效应细胞的增殖。早期研究倾向于使用单一剂量的环磷酰胺实现淋巴细胞清除，近期则有报道称添加氟达拉滨或全身辐照会更有效。
TIL治疗在黑色素瘤领域研究最为广泛，也有新的数据表明TIL在其他各种实体肿瘤中也有潜在的治疗作用。目前的免疫治疗仍普遍鉴于ICI，而ICI本质上依赖于肿瘤反应性T细胞，因为它的主要作用机制是消除免疫系统上的损伤。鉴于部分患者的肿瘤效应T细胞存在功能失调甚至耗竭，IC治疗可能耐药或失效。TIL的产生则依赖于T细胞群体的产生，这些T细胞可通过与IL-2共培养和/或选择肿瘤抗原特异性T细胞来克服ICI耐药患者的免疫功能障碍。因此，TIL有望为对ICI有反应的肿瘤带来新的治疗选择。已有研究对TIL应用于肺癌、宫颈癌、头颈部肿瘤等展开探索，初步证实了TIL的临床应用前景。
TIL仍未得到广泛应用，因为其仍存在未克服的弊端。通常TIL的制备需要5~7周的时间，这对于一些转移性疾病患者而言太久了。另外，多次分离的TIL可能生长及效应力都会减弱，无法达到免疫治疗的效果。部分研究开始尝试联合免疫检查点抑制剂使用TIL，以期获得更佳疗效。经免疫治疗发生疾病进展的转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者在接受TIL输注后，再恢复使用纳武利尤单抗，取得了可喜的效果。这意味着TIL有望改善ICI的应用。
图1. CAR-T治疗与TCR-T治疗
Ø 基因工程TCR
TCR工程T细胞技术是TIL治疗理论的进一步延伸。TIL表面具有获得性肿瘤识别功能，这就意味着存在通过基因修饰原始淋巴细胞来识别肿瘤抗原的可能。TCR的α和β链是决定T细胞抗原特异性的关键成分。这些TCRɑ和β异质二聚体形成TCR-CD3信号复合物，具有由人类白细胞抗原（HLA）依赖机制提供的靶抗原特异性。
既往研究已经实现通过逆转录病毒载体转导建立TCR框架，并在黑色素瘤患者中取得了消退肿瘤的效果。针对不同抗原靶点的试验也分别显示了TCR在不同实体肿瘤类型中的临床活性。但相关安全性数据也表明，TCR工程T细胞治疗导致部分患者经历了危及生命的神经毒性反应。如何优化这些TCR，以避免脱靶效应、避免潜在的高危副作用，都仍有待进一步探索。
TCR工程T细胞过继疗法还被认为对病毒介导的癌症有特别的潜力，诸如HPV介导的宫颈癌、EB病毒介导的鼻咽癌等。基于HLA机制呈递的病毒抗原在正常组织中较少出现，因此针对病毒抗原的基因工程TCR能够更加针对性地发挥作用。HPV相关研究已经证明，TCR工程T细胞治疗有不错的临床反应，且没有发生细胞因子释放综合征（CRS）。
然而，病毒介导的恶性肿瘤只占癌症流行病学的一小部分。要想扩大基因工程TCR技术的应用，可能在很大程度上依赖于新抗原的鉴定和靶向。这些候选抗原表位必须是由体细胞突变产生的，在正常细胞上不表达。肿瘤新生抗原T细胞的鉴定将有助于构建高度个性化和特异性的TCR细胞治疗产品。BRAF V600E或PIK3CA55等潜在驱动癌基因的新抗原已被视为潜力靶点，或可用于开发泛癌种的TCR治疗。
如果重新设计的TCR无法有效地传输到肿瘤部位，无论治疗策略在理论上是多么成功，最终都可能是无效的。为了克服这一障碍，TCR疗法在多种肿瘤类型中的应用都是局部的。这样做的另一个好处是有望避免一些TCR治疗相关的全身毒性。此外，提高肽MHC-TCR相互作用的亲和力、减少来自天然TCR的竞争等，都可能有助于保障基因修饰TCR的浓度，增强其靶向效应。
Ø CAR-T细胞治疗
与TCR基因工程T细胞类似，CAR-T细胞也是经过基因修饰的淋巴细胞，对肿瘤抗原具有特异性。与TCR相比不同的是，CAR-T细胞识别不依赖于HLA呈递的细胞外抗原。CAR-T细胞由允许细胞增殖的T细胞激活域和赋予靶向特异性的单链可变片段组成。
虽然最初一代的CAR-T细胞无法维持比较长久的T细胞免疫反应，但随后一代的CAR-T细胞在加入包括一个或多个共刺激域（通常是CD28或4-1BB）后，获得了增强的增殖能力。首个成功开发的CAR-T细胞治疗是特异性针对CD19的，最终被FDA批准用于急性淋巴母细胞白血病和难治性大B细胞淋巴瘤的治疗。目前，CAR-T细胞在实体肿瘤中的应用，以及针对不同靶点的开发，都正在积极研究中。
近期一项研究使用靶向IL-13受体α2 （IL13Rα2）的颅内CAR-T细胞治疗多灶性多形性胶质母细胞瘤（GBM），发现肿瘤完全消退，且效果持续了近8个月。另一项I期试验研究了靶向ROR1的CAR-T细胞的安全性和初步疗效（clinicaltrial.gov登记编号：NCT02706392），ROR1是一种跨膜酪氨酸激酶受体，发现于乳腺癌和肺癌。该研究的初步数据显示，5例乳腺癌和肺癌患者中有4例在一些转移部位出现了混合反应，肿瘤负荷总体减轻。这些研究都表明，CAR-T细胞应用于实体瘤治疗存在一定的可行性。
此外，针对其他一些新靶点的CAR-T治疗也已显示出初步疗效。一项I期开放标记剂量递增研究发现，HER2 CAR-T细胞对胶质母细胞瘤患者无剂量限制性毒性，细胞输注后的中位总生存期达到11.1个月。针对前列腺特异性膜抗原（PSMA）、Claudin18.2等靶点的CAR-T细胞也在临床研究中取得了一定的进展，证实其或有潜力治疗前列腺癌、胃癌、胰腺癌等恶性实体瘤，且不良事件相对可控。
然而，用于实体肿瘤的CAR-T细胞的发展一直很困难。虽然CAR-T治疗不依赖于HLA特异性识别，这一有别于TCR治疗的优势也存在限制性；因为理论上其只对一个特定的细胞外靶点有效，而许多实体肿瘤可能不存在特定的细胞外靶点。此外，目前CAR-T细胞有限的抗原敏感性使得肿瘤细胞相对容易下调目标抗原，这也是CAR-T获得性耐药的一个机制。克服这一问题的一种策略是通过“T细胞重定向、不受抗原限制、细胞因子启动的杀伤效应”（T cells redirected for antigen-unrestricted cytokine-initiated killing，TRUCKs）。第四代CAR-T细胞产品已经结合了针对特定抗原的CAR和诱导细胞因子释放的转基因蛋白，未来的CAR-T策略可能包括组合细胞因子、多靶点方法和新的组合免疫治疗策略，协同克服肿瘤相关抗原的异质性和实体肿瘤间质微环境的免疫抑制。
【挑战】过继免疫细胞治疗挑战重重
1. 靶抗原异质性不稳定和抗原逃逸
靶向抗原的异质性是阻碍过继免疫细胞治疗在实体肿瘤中应用的主要原因，尤其是TCR和CAR-T细胞治疗，更容易受到这一点的阻碍。过继免疫细胞治疗在血液系统恶性肿瘤中成功实践很大程度上取决于三个因素：一是有一个明确的可识别抗原（CD19），二是这种抗原在病变范围内是均匀表达的，三是过继免疫细胞在身体其他部位的治疗相关毒性（即脱靶效应）是可控的，允许存在一个较宽的治疗窗口。
实体肿瘤的抗原谱比血液肿瘤更具有异质性，且相较于正常组织，这些抗原确实在肿瘤组织中发生过度表达。然而，由于实体肿瘤内的异质性和基因组不稳定性，这些抗原的表达水平通常并不一致。另外，弥漫性转移疾病的肿瘤内异质性也是值得关注的问题。
针对耐药机制的探索也不容忽视。近期研究发现，靶向表皮生长因子受体变种III （EGFRvIII） 的CAR-T细胞在治疗复发性胶质母细胞瘤时，肿瘤发生了显著的适应性反应，阻碍了过继免疫细胞输注后对恶性细胞的破坏。这种适应性的代偿反应进一步增加了优化恶性实体肿瘤细胞治疗的难度。
克服抗原逃逸和异质性的一种策略是通过使用包含互补抗原的多抗原识别通路，比如类Notch受体诱导CAR-T，以及双特异性CAR-T等。相较于单一靶向的CAR-T治疗，这些策略都取得了更好的抗肿瘤效应，但相关技术尚不成熟，临床数据也较少；此外，脱靶效应和剂量限制毒性都是亟待解决问题，需要严格控制。
2. T细胞的迁移和渗透受阻
为了使效应T细胞介导的细胞死亡发生，T细胞必须能够有效地迁移到肿瘤部位，并克服阻止其渗透的抑制性细胞因子。研究表明，许多转移性病变缺乏淋巴细胞，这提示转移肿瘤中可能缺乏充分的效应T细胞定位靶点。
一项针对黑色素瘤的研究发现，CD8+ T细胞浸润较大的转移部位有六种趋化因子亚群的优先表达，分别为CCL2， CCL3， CCL4， CCL5， CXCL9和CXCL10。虽然这些趋化因子亚群可能并不适用于所有实体肿瘤恶性肿瘤，但这一研究结果说明，关键的趋化因子受体/配体匹配对于效应T细胞迁移是必要的。此外，由于趋化因子/受体不匹配和抑制性细胞因子导致的ACT无法传输到肿瘤部位，也会干扰这些疗法在实体肿瘤中的疗效。提振促进浸润的趋化因子、阻断免疫抑制相关因子，都将有助于过继免疫细胞向实体肿瘤区域浸润，发挥更针对性的抗肿瘤效应。
图2. 实体瘤ACT应用挑战重重
3. 肿瘤微环境免疫抑制
实体肿瘤微环境通过多种机制实现了对效应T细胞的抑制，包括阻碍T细胞浸润和降低环境能量供给。即使过继免疫细胞治疗产品能够有效地运送到肿瘤，也必须克服实体瘤内部复杂的微环境情况，包括细胞外基质改变、血管系统异常、组织间液压力变化和缺氧等。
许多与肿瘤相关的髓系细胞能够产生免疫抑制细胞因子（如IL-10和TGF-β），进而阻断T细胞介导的肿瘤杀伤。此外，持续的抗原暴露和炎症信号暴露都会导致T细胞功能的耗竭。
如何保障进入实体瘤的T细胞治疗发挥持续功能、免于最终衰竭，对于ACT的开发与临床应用都是至关重要的。现有研究仅说明了实体肿瘤患者对免疫治疗的抗性可能与CD8+ T细胞的浸润比率相关，但肿瘤微环境的抑制信号网络究竟如何影响T细胞族群和功能的改变，仍未被具体阐明。新兴的CRISPR技术近期被用于识别影响T细胞功能的关键基因，或将有助于筛选或制造出能够对抗多种抑制途径的T细胞。
【前景】
未来，ACT的开发将聚焦于增强临床疗效和克服耐药机制两方面，并在很大程度上依赖于联合治疗方案，或是基于现有细胞治疗产品的改构，以增强临床疗效和克服耐药机制。
免疫检查点抑制剂或细胞因子调节剂（如CD40）的加入可以帮助增强T细胞的浸润、增殖能力，并克服抗原逃逸。靶向肿瘤微环境和/或间质的免疫抑制相关因子也可以提高ACT的有效性。
双特异性CAR-T细胞技术、类Notch受体技术、基于CRISPR的促炎基因调控技术、诱导细胞因子CAR-T细胞技术、新抗原TCR技术以及TIL联合方案等，都代表了强化ACT的发展方向。另外，近期mRNA技术的突破也可能对整个细胞治疗和免疫治疗领域产生强烈影响。
Kirtane K， Elmariah H， Chung CH， Abate-Daga D. Adoptive cellular therapy in solid tumor malignancies: review of the literature and challenges ahead. J Immunother Cancer. 2021 Jul;9 (7):e002723. doi: 10.1136/jitc-2021-002723. PMID: 34301811; PMCID: PMC8311333.
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