主持研究生创新基金：游离DNA在直肠癌中的预测作用YJSCX201808，0.6万
参与重庆市科卫联合医学科研项目 青年项目，2019QNXM013，液体活检中富集血浆小片cfDNA的新策略及应用，5万。
参与永川区科委，Ycstc,2019nb0202, 基于AIEMs磁珠分离cfDNA的条件优化及应用，2万。
基本熟悉SPSS、PCR的操作流程。
前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤之一， 2018 年全球癌症统计数据显示全球前列腺癌新增病例约 130 万，因前列腺癌死亡的人数达 35.9 万，前列腺癌已成为世界范围内男性发病率第二的恶性肿瘤，仅次于肺癌[1]。
近年来，国内前列腺癌发病率也有明显增高的趋势。文献报道目前我国前列腺癌的发病率约为 9/10 万[2]。随着我国人口寿命的延长，前列腺癌的发病率将不断上升。血清前列腺特异性抗原（PSA）水平升高通常在前列腺癌的背景下出现，但也可能反映其他前列腺疾病：良性前列腺增生，前列腺感染和前列腺梗塞[3]。最近一项评估了ERSPC和PLCO临床试验的报道表明PSA测试减少了大约30%由前列腺癌导致的死亡[4]。然而,前列腺癌筛查标志物PSA特异性较低，在升高的PSA中进行组织活检发现只有40%-50%的前列腺癌[5]。对于局限性前列腺癌来说，根治性切除仍然是NCCN指南强烈推荐的治疗方式，然而，有多达30%接受根治性前列腺癌患者最终复发[6]。局限性前列腺癌5年的相对生存期为100%，而转移性5 年相对生存率为29.8％[5]。因此，迫切需要更加敏感的指标进行风险分层和预后来改善局限性前列腺癌患者的管理，并识别进展风险较高的病例，减缓或避免进展为转移性前列腺癌。
液体活检主要包括循环肿瘤细胞（circulating tumor cells CTCs）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA ctDNA）等。作为精准医疗时代体外诊疗技术中的代表，具有非侵入性、重复性强等优势，其在转移性前列腺癌的诊断、治疗决策、疗效及预后中都有广阔的应用价值。然而，其在局限性前列腺癌中的研究较少，因此本研究通过总结液体活检在局限性前列腺癌中的应用来探讨其应用价值及发展方向。
CTCs是从原发或继发肿瘤部位分离并侵入血流的细胞。作为转移扩散的主要参与者，CTC代表着非常有前途的生物标志物，可以帮助癌症诊断，治疗决策和患者随访[7]。CTCs 检测方法很多，大致分为富集和分析两类，富集技术常见的有细胞大小分离法、密度梯度离心法和免疫磁珠分选法等；常见的分析技术包括流式细胞分析、免疫荧光技术、反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法、基因芯片等[8]。CellSearch 检测系统兼有富集和分析功能，是全球第一也是唯一经美国食品和药物管理局（FDA）和加拿大卫生部的批准用于CTCs检测的新技术，可用于转移性乳腺癌，前列腺癌和结直肠癌的诊断及预后。 CellSearch 检测系统将具有上皮细胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM）+、细胞角蛋白（Cytokeratin , CK）+、DAPI+ 和 CD45-表型的细胞归类为肿瘤细胞[8]。然而，研究表明采用cellsearch方法检测局限性前列腺癌中的循环肿瘤细胞含量很低，在152个病人中只发现17个CTC阳性的患者[10]。不同的研究使用不同的cutoff值定义CTC阳性使得比较其结果变得更加复杂，同时许多研究表明CTC数量与临床变量（例如OS、PFS，Gleason评分，肿瘤分期或术前血清PSA水平、生化复发）之间均无显著相关性[10-12]。
上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）指的是上皮细胞在一些因素的作用下，细胞逐渐丧失作为上皮细胞原有的极性、细胞间的紧密连接从而获得侵袭性和游走迁移，在这个过程中产生大量的细胞外基质成分，抑制了细胞的凋亡，最终转换成为具有间质细胞形态和特性的细胞。EMT在CTCs形成过程中发挥着重要作用。一方面，通过增加细胞迁移和侵袭能力，促使其突破基膜；另一方面，通过促进血管生成和内渗协助肿瘤细胞侵入血液循环，即形成CTCs，这些发生EMT的CTCs不仅具备了高侵袭、转移能力，且抵抗凋亡能力较强，即容易扩散、存活、形成远处转移灶[13]。pEMT指动态或稳定的处于上皮和间充质中间的状态[14],这种状态更加容易形成转移灶[15].上皮间质转换学说的提出给CellSearch等基于上皮型抗原检测的CTCs分析技术带来了巨大的挑战[16],仅仅检测EpCAM等上皮型抗原必然会大大影响检测结果，降低检测阳性率。同时最近的研究表明EMT CTC不仅局限于转移性肿瘤，其在某些早期肿瘤中也显示出临床意义。一项招募了86例早期乳腺癌患者的研究表明：37.2%的病例中检测到CTC，其中CTC与肿瘤的大小、分期、分子类型相关，并初步表明EMT CTC与新辅助化疗的有效性相关[17]。一项采用微流控平台“CTC芯片”的研究能够在精确控制的层流条件下，通过目标ctc与抗体(EpCAM)涂层微柱的相互作用，高效和有选择性地从外周血全血样本中分离活的ctc，且无需对样本进行预先标记或处理，其测得局限性前列腺癌的CTC含量接近转移性前列腺癌[18]。另一项研究利用微流控棘轮机制富集CTC，允许根据大小和变形能力的差异从白细胞中分离CTC。用针对全细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子和CD45的抗体对富集的细胞进行免疫荧光染色，CTC在其中50%的患者中被检测到，然而CTC计数与前列腺特异性抗原浓度、肿瘤分期、淋巴结分期或Gleason分级之间却没有相关性[19]。另一项针对651位局部结直肠癌患者的研究中，在535位患者中发现了CTC，其中461位具有pEMT，与临床分期相关[20]。基于大小的CTC富集技术CanPatrolTM 对局限性前列腺癌中的CTC进行检测得出55%的患者中存在CTC，同时其与局限性前列腺癌中的PSA，Gleason评分，风险分层及病理分期存在密切相关性,其中pEMT CTC数量与与器官局限程度和向包膜侵犯程度都密切相关[21]。因此，单纯采用CellSearch的检查技术会遗漏许在浸润及转移中起关键作用的肿瘤细胞，开发能够检测EMT过程中所有CTC的检测手段意义重大。
循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA ctDNA）是从原发肿瘤、循环肿瘤细胞或转移性肿瘤中释放到血液的单链或双链DNA，含有与原始肿瘤细胞相同的基因组成和异质性[22]。其确切的起源及释放机制不完全清楚，主要与肿瘤细胞的凋亡、坏死及分泌有关。ctDNA的检测方法包括聚合酶链反应（polymerase chain reaction， PCR）和二代测序（next generation sequencing, NGS）。检测血浆中的ctDNA可识别原发肿瘤存在的点突变、拷贝数变异以及染色体和表观遗传学改变[23]。表观遗传改变很稳定，对特定的基因来说改变非常频繁，可通过微创的方式检测，具有很高的潜力，可为癌症提供创新的生物标志物[24]。在表观遗传学改变中，DNA甲基化以影响基因功能相似的方式影响基因表达，在所有类型的癌症中起着至关重要的作用[25]。血浆中DNA甲基化模式的变化发生在癌症发病的早期[26]。有研究使用Marmal-aid数据库和内部数据集确定了Pca组织中甲基化程度最高的三个顶级候选物：DOCK2、HAPLN3和FBXO30，尽管在98%-100%匹配的根治性前列腺切除组织样本中呈阳性信号，但在局限想性前列腺癌中都未检测到甲基化的ctDNA，而在转移性前列腺癌中有61.5%都有表达，这表明该DNA没有释放或泄漏到循环中并以足够的量被检测到[27]。另一项研究应用超低通全基因组测序对112名确诊为局部前列腺癌的患者的细胞游离DNA进行了分析，并对9例患者的血浆DNA进行了靶向重测序，以检测之前在匹配实体瘤中发现的体细胞突变。然而，在所有的局限性前列腺癌患者中包括高危风险的患者中都未检测到ctDNA，但在转移性前列腺癌中，两种方式都检测到了ctDNA。这表明原发性和转移性前列腺癌之间的内在差异，包括ctDNA脱落和更新的动力学及局部疾病的低增殖率和相对于转移更远的血管距离从而导致cfDNA到达循环之前降解[28]。另一项研究接受前列腺切除术的临床局限性前列腺癌患者进行了全基因组测序，确定了高可性度的基因组畸变，得出CtDNA在局限性前列腺癌中很少被发现，但它的存在预示着疾病的发展更加迅速，至于ctDNA检测率低则除过上述原因外还要考虑患有真正高危疾病的患者太少而无法检测到阳性信号[29].
液体活检一直是研究的热点，其在转移性前列腺癌的诊断、治疗评估、预后及疗效判断中都扮演着重要的价值，然而，对于局限性前列腺癌，其研究相对较少，原因可能是CTC及ctDNA的含量在血液中较低，同时对于EMT目前仍存在许多未能明确的地方，包括转化过程中CTC的类型及在肿瘤进展过程中所起到的作用，因此未能高选择性检测。同时，更加敏感、效能更高的检测手段的匮乏也是影响因素之一。因此，研究EMT的作用过程，并开发更加敏感的检测手段将是液体活检在局限性前列腺癌中研究必不可少的环节。
ERSPC：欧洲前列腺癌筛查 PLCO：前列腺癌，肺癌，结肠直肠癌和卵巢癌的筛查试验。
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