化疗耐药仍然是治疗许多淋巴瘤患者时面临的一个具有挑战性的临床问题。表观遗传紊乱在之前的研究当中被发现与原发和获得性化疗耐药都有关。表观遗传过程中的突变可以改变整个信号通路网络。它们影响肿瘤抑制因子、DNA损伤反应、细胞周期调节和细胞凋亡。表观遗传改变与免疫逃逸也有关。目前关于CpG位点DNA甲基化增加的研究最为广泛。在淋巴瘤的临床前模型和患者研究中都已证实，组蛋白甲基化增加和组蛋白乙酰化减少也与干细胞样特征和高度侵袭性疾病状态有关。这些变化是非随机的，它们呈簇状发生，并且在许多淋巴瘤亚型中都可以观察到。尽管表观遗传疗法与其他抗肿瘤药物联合使用时必须谨慎，但是单用表观遗传疗法很少引起有意义的临床疗效。淋巴瘤患者的化疗、靶向治疗和免疫治疗的表观遗传启动有可能克服耐药性。
江苏省六大高峰人才
中华医学会血液学分会淋巴细胞疾病学组委员
中国抗癌协会淋巴瘤专业委员会委员
中华中医药学会血液病分会委员
中国女医师协会靶向专业委员会委员
江苏省研究型医院协会淋巴瘤专业委员会常委
江苏省医学会血液分会淋巴瘤骨髓瘤学组委员
江苏省抗癌协会淋巴瘤专业学组委员
江苏省肿瘤防治联盟淋巴瘤专家委员会常委
江苏省研究型医院协会白血病/MDS专业委员会常委
江苏省抗癌协会白血病/MDS专业学组委员
江苏省医学会医学鉴定常任专家
美国血液学会会员
1990年南京医科大学临床医学专业毕业至南京鼓楼医院血液科工作至今。具有30年的血液病的临床、教学和科研工作经验。
中国药科大学临床药学（医院药学）硕士研究生
临床病例
2014年，一名44岁的女性表现为右腰部和盆腔疼痛，6个月盗汗，体重减轻10公斤。既往病史有明确的使用非甾体抗炎药后胃溃疡出血。实验室检查异常值：血红蛋白7.0g/dL；乳酸脱氢酶605U/L；碱性磷酸酶209U/L；γ谷氨酰转移酶16U/L；白蛋白3.2g/dL；钙10.6 mg/dL。PET-CT显示肺门、主动脉旁、肠系膜和髂骨淋巴结病变，肾肿块累及双侧腰大肌和弥漫性骨病，SUV值高达21。腰大肌活检组织学检查显示骨骼肌弥漫性细胞浸润，大细胞CD30、CD25、CD4和CD5阳性，间变性淋巴瘤激酶(ALK)阴性，与ALK-间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)一致。患者进入ECHELON-2临床试验，随机接受环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松(CHOP)或布妥昔单抗加环磷酰胺、阿霉素、强的松治疗。经过6个周期后的治疗后，她获得部分缓解，并接受自体干细胞移植巩固。移植后，由于她的肱骨头部持续存在疾病，她接受了3000 cGy的放射治疗。6个月后，患者再次出现颈部和盆腔淋巴结病变，并接受了一项联合表观遗传的临床试验，该疗法联合使用表观遗传治疗药罗米地平和新型抗叶酸药普拉沙曲。经过2个月的治疗，PET/CT证实完全缓解。患者接受了为期1年的治疗。截至2020年6月，她仍未患病，身体健康，没有任何不良后遗症。
导言
对耐药性的认识始于抗生素有效性的研究。1943年，Luria和Delbrück发现了抗生素耐药性。他们的许多发现已经被应用于癌症化疗耐药研究。正如Fox 和 Loeb所说，“癌症是达尔文进化的一个缩影：肿瘤进展是一个突变驱动的过程。这种进展通过优先复制最适宜的变异体，使异质细胞群体适应不同的微环境实现。”
淋巴瘤患者发生化疗耐药有两个主要机制：原发性耐药和获得性耐药。原发性耐药是指在没有接受过任何化疗的情况下对治疗产生的耐药性。它与药物转运减少、药物分解、靶点表达或作用改变、淋巴瘤特定的内在生物学特性有关，例如细胞周期调节因子的改变，以及DNA损伤修复机制的改变。具有这些特征的淋巴瘤通常从一开始就预后非常不佳，例如细胞周期素D1易位和p53突变特征的母细胞型套细胞淋巴瘤。获得性耐药指的是易感肿瘤在反复接受化疗后变得具有耐药性。发生获得性耐药的原因有导致肿瘤基因变化的环境因素、影响药物的新陈代谢变化、微环境和免疫监视的改变以及整个信号通路网络的复杂变化。这些改变往往与特定的化疗药物无关，而是肿瘤内异质性和随机自发事件的结果，这为克隆亚群的扩大创造了选择压力。这些机制可能单独发生，更可能同时发生，从而增加了发生耐药的机会。
图1
表1
克服化疗耐药和扩大传统化疗和新型药物的疗效正在研究中(表1)。表观遗传紊乱会产生整体影响。与特定肿瘤抑制基因的直接遗传改变相比，表观遗传紊乱同时影响更多的通路(图1)。通常，表观遗传过程中的改变不是孤立发生的，而是在多个表观遗传控制中同时发生，这种现象给利用表观遗传靶向治疗克服化疗耐药创造了机会。本文建立在“利用淋巴瘤表观遗传学改进治疗”这篇文章的基础上。更好地理解靶向表观遗传学如何用于克服化疗耐药性，有望激发创新疗法，以提高复发/难治性淋巴瘤患者的治疗效果。
表观遗传因素与原发性和获得性耐药有关
表观遗传可塑性与体细胞突变共同作用，使暴露于化疗后的肿瘤细胞通过多种机制存活，从而产生淋巴瘤耐药亚群。表观遗传多态性或表观多态性证明淋巴瘤患者间和患者体内存在多样性，并且这种多样性会随着耐药克隆的发展而进化。表观等位基因是指，DNA序列相同但甲基化模式不同的等位基因。化疗后，肿瘤细胞发生了显著的表观等位基因改变，耐药克隆被筛选出来，表观多态性减少。
DNA甲基化是被最广泛研究的导致化疗耐药表观遗传学过程。研究人员创建了一个进化树，将淋巴瘤亚型滤泡性淋巴瘤(FL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的甲基化水平与正常B细胞的模式联系起来。他们发现，淋巴瘤细胞甲基化模式与正常B细胞差异越大，患者存活率就越差。即使在不同分级滤泡细胞淋巴瘤之间也是如此。此外，异常甲基化模式不是随机的，而是定位在BCL6、EZH2和MYC等关键调控因子的启动子区域。在这些观察的基础上，研究人员研究了复发后保持持久治疗反应的DLBCL患者之间的甲基化异质性。他们观察到在启动子区域富集的差异化高甲基化区域，特别是在调控元件如CTCF。CTCF是一种染色质结合因子，通过与组蛋白乙酰化酶和脱乙酰酶的相互作用调节DNA甲基化的扩散。在淋巴瘤的临床前模型中，利用对马磷酰胺耐药的细胞系，研究人员证明了对胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)位点的甲基定量，可以区别淋巴瘤亲本细胞和耐药细胞系之间甲基化的差异。作者发现，DNA结合、转录因子活性和细胞分化的功能丰富的基因区域甲基化明显增加。此外，组蛋白甲基转移酶多聚梳抑制复合体2的成分在耐药细胞系受抑制的基因处显著富集，组蛋白去甲基酶Uty下调，导致染色质收缩和基因表达降低。研究人员发现，耐药细胞的表达特性与祖B细胞相似，重现了干细胞样特征。同样，在ALCL的一项研究中，研究人员发现，与化疗敏感的ALK+亚型相比，侵袭性耐药ALK-亚型的CpG岛甲基化水平显著增加。此外，来自复发ALCL患者的样本也有更高的甲基化水平。有趣的是，研究人员发现耐药ALCL的高甲基化模式与DLBCL的特征相似，表明这些模式可能不是随机事件，而是在淋巴瘤各种亚型中普遍存在。在接触DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂5-氮杂胞苷后，更具侵袭性的淋巴瘤的高甲基化信号恢复到ALK+ALCL水平。一项研究旨在更好地了解DNA甲基化对化疗耐药的作用以及开发出逆转这些作用的治疗方法。通过这项研究人们发现，在耐药的DLBCL中，转化生长因子β通路的Smad1成分被异常的DNA甲基化沉默。用DNMT抑制剂治疗逆转了这一现象，并使细胞对阿霉素敏感。这些发现被转化为阿扎胞苷和利妥昔单抗联合CHOP化疗治疗DLCBL患者的临床试验，结果显示耐受性良好，12名患者中有11名完全缓解。
除了DNA甲基化，组蛋白的表观遗传修饰被认为是化疗耐药的一个重要因素。Zeste基因增强子同源物2(EZH2)和多聚梳抑制复合体2在启动子区域（可被高甲基化）招募DNMT和DNA簇，直接导致转录沉默。
在依托泊苷耐药的淋巴瘤细胞系中，EZH2表达促使细胞衰老而不是凋亡。抑制EZH2表达可以克服化疗耐药，机制是调节MDM2样p53结合蛋白诱导p53持续表达，同时上调p21。在临床前化疗耐药模型中，EZH2介导的Schlafen 11(SLFN11)沉默导致DNA损伤修复受损。最近的研究发现，SLFN11是一种DNA复制抑制因子，是对阿霉素、铂、甲氨蝶呤等药物反应的基因组决定因素。在耐药模型中，用EZH2抑制剂处理可恢复SLFN11的表达并诱导化疗敏感性。端粒沉默1-样干扰因子(DOTL1)是一种H3k79甲基转移酶，通过同源重组促进DNA修复。抑制DOTL1可以阻止p53结合蛋白1(53BP1)在双链断裂位点的募集。因此，DOLTL1抑制剂可以使癌细胞对DNA损伤剂敏感。DOTL1抑制剂Pinometostat(EPZ-5676)目前正在进行临床试验。组蛋白赖氨酸去甲基酶KDM6B被发现与接受利妥昔单抗联合CHOP化疗的DLBCL患者的生存期降低有关。对181例患者的评估发现，KDM6B高表达者的存活率为48%，低表达者的存活率为71%。当研究人员用KDM6B抑制剂GSK-J4处理淋巴瘤细胞系时，他们发现联合化疗时细胞凋亡率显著增加，提示化疗增敏。作者还发现，GSK-J4影响了B细胞受体信号转导和B细胞淋巴瘤6(BCL6)的表达，这表明这种治疗可能会改变这些疾病的驱动因素。
已知组蛋白乙酰化可影响多种细胞机制，包括细胞凋亡、DNA损伤反应、细胞周期、自噬、蛋白质降解和免疫反应。通过调控这些通路，靶向组蛋白乙酰化的疗法已成为克服耐药性的一种策略。这种疗法主要通过抑制组蛋白去乙酰化酶(HDAC)实现，HDAC抑制剂对化疗耐药的T细胞淋巴瘤模型有效。美国食品和药物管理局(FDA)批准了三种HDAC抑制剂，用于治疗复发/难治性T细胞淋巴瘤：伏立诺他、罗米地辛和贝利司他；西达本胺在中国获得批准。回到我们的病例，罗米地辛显示了25%到39%的总应答率(ORR)。在Coiffier等人发表的研究中，有21名ALK-ALCL患者，虽然这种疾病实体没有表观遗传学失调的特征，但24%的ALCL患者对治疗有反应。HDAC抑制剂上调p21的表达被认为是化疗耐药淋巴瘤再次化疗敏感的一个潜在机制。在包括DLBCL、套细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤在内的几种淋巴瘤亚型中都发现了这一点。在一项对原发难治性DLBCL患者样本的研究中，伏立诺他抑制了细胞活力，诱导了p21的表达，下调了细胞周期蛋白依赖性激酶2的表达，导致了对化疗的再敏感。在利妥昔耐药的DLBCL细胞株中，恩替诺特导致bcl-xl水平降低，p21增加，并增强了阿糖胞苷的作用。同样，在霍奇金淋巴瘤细胞系中，伏立诺他可诱导p21的表达，下调细胞周期蛋白D2的表达，从而与顺铂产生协同的细胞毒作用。
抗CD20单抗治疗的B细胞淋巴瘤经常发生CD20表达下调，导致对利妥昔单抗产生耐药性。CD20编码基因MS4A1的表观遗传改变已被证明可导致CD20丢失。用HDAC6选择性抑制剂Acy-1215处理已被证实可诱导CD20表达并使细胞对利妥昔单抗增敏。这一点在恩替诺特和西达本胺中也得到了证实，这表明它们是同一种级别的效应。
表观遗传学对小分子靶向的信号通路也有影响。例如靶向Bruton酪氨酸激酶(BTK)的抑制剂伊鲁替尼，已发现套细胞淋巴瘤对其耐药。虽然BTK结合位点的突变是导致伊鲁替尼耐药的原因之一，但导致NF-κB信号转导的其他途径的激活也起到了一定的作用，例如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-AKT的激活。HDAC抑制剂已被证明通过调节JAK/STAT通路来增强PI3K抑制剂的活性。因此，HDAC/PI3K双重抑制剂CUDC-907在BTK耐药套细胞淋巴瘤和DLBCL临床前模型中显示出活性。
HDAC抑制剂可以诱导线粒体和死亡受体的凋亡通路。研究人员在一组依托泊苷耐药的淋巴瘤细胞系中发现了突变的BCL2。用罗米地辛处理后会导致热休克蛋白90的乙酰化和失活，从而使Bcl2样蛋白11表达上调。尽管这种效应是基于翻译后修饰而不是表观遗传修饰，但BCL2样蛋白11在多种淋巴瘤亚型使用HDAC抑制剂后都被证实。因此，HDAC抑制剂与BCL2抑制剂(如维奈克拉)联合使用已显示出很有前途的结果。
表观遗传药物诱导的翻译后修饰能影响许多已知的导致化疗耐药的途径。P53活性受损就是这样一个例子。虽然有许多机制会导致p53活性降低，但p53的乙酰化激活了肿瘤抑制因子并保护其免于降解。用sirtuin抑制剂(三类HDAC抑制剂)治疗可以诱导p53的乙酰化。HDAC抑制剂可以影响主要调控基因和关键癌基因(如BCL6)的作用。我们实验室通过加强癌基因BCL6的乙酰化，取消其作用，以及p53的乙酰化激活抑癌因子，证明了罗米地辛与烟酰胺(sirtuin抑制剂)之间的协同作用。罗米地辛已被证实下调BCL6，并影响其靶基因，如细胞周期素D2和PRDM1。这又导致了与溴结构域和超末端结构域(BET)抑制剂JQ1对MYC的协同靶向。
表观遗传学和免疫疗法的交叉作用
免疫逃逸逐渐被认为是淋巴瘤疾病进展的一种机制(图2)。微环境中免疫监视的表观遗传调控是已被深入研究 (表2)。获得性化疗耐药与程序性细胞死亡1(PD-1)和程序性死亡配体1(PD-L1)的表达增加有关，这两种基因已被证明是受表观遗传控制的。Pdcd1启动子区域的DNA重新甲基化使T细胞处于耗竭状态。检查点阻滞可能会逆转T细胞耗竭状态，但停止治疗后，T细胞会恢复到耗竭的状态。DNMT抑制剂的治疗已被证明是对检查点阻滞的补充，能够恢复T细胞反应。此外，PD-L1和PD-1启动子区的组蛋白乙酰化与PD-L1的表达有关。因此，HDAC抑制剂的治疗已经被证明能增加PD-L1和PD-1的表达。这些研究很多都是在实体器官恶性肿瘤或感染的临床前模型中进行的；然而，他们的发现目前正在淋巴瘤模型中进行探索，并已迅速转化为复发/难治性淋巴瘤的临床试验(表2)。
图2
表2
生发中心BCL、DLBCL和FL对检查点抑制反应不明显的部分原因是免疫逃逸。这些实体以EZH2突变激活和乙酰基转移酶EP300和CREBBP突变失活为标志。EZH2抑制T细胞的活性并调节趋化因子，导致抗肿瘤免疫降低。研究人员发现，使用EZH2抑制剂CPI-1205治疗，可重新编程T细胞抗肿瘤免疫，抑制调节性T细胞，并改善抗-CTLA4治疗的反应。EZH2和乙酰基转移酶的错配与主要组织相容性复合体(MHC)表达减少和肿瘤浸润性淋巴细胞有关。用EZH2抑制剂治疗后，Ⅱ类MHC反式激活增强子的表达增加，恢复了MHCII的表达。此外，细胞程序性死亡1和CTLA4在EZH2抑制后增加。CREBBP增强PDL1的MHCII表达并取消PDL1对BCL6的抑制。导致CREB结合蛋白(CREBBP)不足的突变与B细胞与T细胞的结合受损以及T细胞的扩增、激活和抗肿瘤免疫功能降低有关。靶向性的使用HDAC3抑制剂在DLBCL的临床前模型中被证明是可以逆转耐药， 使HDAC3抑制剂与PD-L1抑制剂具有协同细胞毒性。在对来自12名原发难治性疾病患者的显微解剖的霍奇金Reed-Sternberg细胞的基因组分析中，12例中有4例存在EP300或CREBBP突变，表明这种突变可能在降低抗肿瘤免疫力。这些研究表明，用表观遗传调节剂可能增强免疫检查点抑制，从而对免疫监视受损的疾病治疗有效(表2)。
在外周T细胞淋巴瘤(PTCL)中，尤其是滤泡辅助细胞起源的淋巴瘤，如血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤，常可观察到Tet甲基胞嘧啶双加氧酶2(TET2)的突变。TET2是一种将5-甲基胞嘧啶转化为5-羧基胞嘧啶的双加氧酶。此外，在高达45%的血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤患者中检测到突变的异柠檬酸脱氢酶1/2，这种酶突变所产生的致癌性代谢产物羟基戊二酸使TET2酶失活。TET2介导的PD-L1启动子区域、趋化因子和干扰素γ途径的去甲基化减少会导致T细胞耗竭。这些作用可被DNMT抑制剂逆转。成人T细胞白血病/淋巴瘤是一种相关的高度侵袭性疾病，与原发和获得性化疗耐药都有关。研究人员调查了成人T细胞白血病/淋巴瘤患者样本，发现58例患者中有25例T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(Tim-3)的表达增加，这与化疗耐药有关。Tim-3在巨噬细胞，树突状细胞，自然杀伤细胞和T细胞等免疫细胞中表达。TIM-3的表达通过下调干扰素途径调节免疫应答，导致T细胞耗竭。TIM-3及其配体LGALS9的表达受启动子区域内CpG岛甲基化的调节，这表明其表达可能受到DNMT抑制剂的调节。
重塑通路导致化疗耐药
表3
已经有大量研究评估淋巴瘤的多几种药物联合表观遗传靶向治疗，因为侵袭性淋巴瘤通常有多种表观遗传紊乱，而单一药物治疗在许多病例中并未证明有效(表3)。在DLBCL的临床前研究中，伏立诺他和地西他滨对耐药细胞系均有细胞毒作用，且两者联合应用具有协同作用。这一点已在其他HDAC和DNMT抑制剂组合中得到证实。研究人员将这些发现转化为针对复发难治性DLBCL患者的1b期研究，并用伏立诺他和阿扎胞苷治疗；然而，该研究因血液毒性和疾病进展而提前结束。有趣的是，18名患者中有7名继续接受进一步治疗，其中2名获得完全缓解；3名从随后的治疗中获得临床益处，起效时间从79天到825天不等。在类似的研究中，研究人员先用西达本胺联合地西他滨治疗复发的DLCBL患者，然后再用利妥昔单抗联合吉西他滨和奥沙利铂治疗。所有入选的13例患者都获得了疾病控制，其中3例患者完全缓解。不出意外，3-4级血液学毒性经常发生，胃肠道副作用、粘膜炎、发热和肝脏异常也是如此。找到合适的剂量计划和患者群体以获得最大疗效，将是成功应用联合表观遗传疗法的必要条件。例如，我们的团队只在EZH2表达或活性紊乱的细胞系中证明了EZH2和HDAC抑制剂之间的协同作用，而在EZH2表达正常的细胞系中没有。我们的团队评估了口服阿扎胞苷和罗米地辛的联合使用的优点，对于这两种药物，大多数反应出现在T细胞淋巴瘤患者中。有趣的是，在3例生发中心来源的B细胞淋巴瘤患者中，1例病情稳定，1例部分缓解，1例完全缓解。尽管生发中心B淋巴瘤的数量非常少，但这种疾病的特点是表观遗传紊乱。
结论
对化疗药物和小分子靶向药物的耐药仍然限制了我们治愈许多淋巴瘤的可能。表观遗传调节药物可以与其他表观遗传靶向药物或小分子一起使用，目的是改变或绕过耐药通路。它们可以用来增强检查点抑制剂的效果。使用联合疗法时必须谨慎，因为毒性可能会限制它们的有效性。由过去的经验可知，单用表观遗传药物不太可能出现有临床意义的结果。识别特定疾病实体的表观遗传紊乱模式可能会为精准医学创造机会，从而使表观遗传疗法能够有效地联合使用。它们最大的作用之一可能是作为化疗或免疫疗法的起始治疗，以克服耐药性。
排版编辑：熊凡
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