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顶尖时课| 革故鼎新，液态活检专场思维碰撞

2019年11月04日

来源：复旦大学中山医院肿瘤防治中心

博采众长显光华，知明行笃见真知。

2019年10月18-20日 “亚洲医学周”之亚洲医学创新与学科发展论坛-2019年复旦中⼭肿瘤国际⾼峰论坛暨复旦中⼭肿瘤防治中⼼年会在复旦⼤学附属中山医院成功举办。

液体活检论坛

10月19日下午，由复旦大学附属中山医院检验科承办的“革故鼎新-液体活检论坛”顺利召开。论坛特别邀请了液体活检领域的知名专家学者复旦大学附属华山医院检验科副主任关明教授、解放军总医院第五医学中心刘毅教授、复旦大学附属中山医院肝外科孙云帆医生、复旦大学附属中山医院呼吸科副主任张新教授、复旦大学附属中山医院肝外科副主任史颖弘教授、同济大学附属同济医院检验科主任李冬教授、复旦大学附属中山医院检验科主任郭玮教授作专题报告，一同分享讨论液体活检技术最新研究进展、在肿瘤诊疗中的临床应用及实践经验，共同推动液体活检技术在肿瘤精准诊疗中的应用和发展。

论坛报告

论坛就“探寻CTC检测技术新方向、聚焦ctDNA临床应用最新进展、关注液体活检临床检测的质量控制”三个议题展开了精彩的学术报告和讨论。

探寻CTC检测技术新方向

关明教授

复旦大学风湿、免疫、过敏性疾病研究中心副主任

中枢神经系统的液体活检

关明教授首先简要介绍了液体活检的基本概念与临床应用进展，从液体活检概念图、液体活检的应用场景出发，对液体活检领域进行了全面而精彩的介绍。当下，液体活检的三驾马车包括循环肿瘤细胞（CTC）、ctDNA及外泌体（Exosomes）。既往研究多关注于血液作为液体活检标本在临床中的应用，而近来研究发现人体多种腔隙内的液体（胸水、腹水、脑脊液等）亦携带有肿瘤相关信息，是辅助诊断疾病的重要标本。因此，应用液体活检技术检测体液样本中的肿瘤信息对于临床肿瘤管理具有重要科学价值，例如应用脑脊液诊断中枢神经系统肿瘤、唾液诊断头颈部肿瘤、胸水诊断胸部肿瘤及转移性肿瘤。

随后，关教授对脑脊液ctDNA检测在中枢神经系统肿瘤中的进展与现状做了介绍。近年来，研究表明肿瘤细胞来源的cfDNA可作为肿瘤特异性的生物标志物，大多数恶性肿瘤血浆中可检测到ctDNA。但在脑部肿瘤中，由于血脑屏障的影响很难检测到ctDNA。脑脊液作为中枢神经系统中的循环液体，已被证实能检测到cf-tDNA，且能反映脑部肿瘤的情况，是检测局限性脑恶性肿瘤的最佳检材。脑脊液cfDNA检测在胶质瘤分子分型、拷贝数变异诊断、肿瘤负荷变化中都展现出重要的临床意义。此外，关教授团队通过对非小细胞肺癌脑转移患者（NSCLC-LM）脑脊液CTC进行单细胞转录组测序分析，发现NSCLC-LM 患者CTC携带有特定的分子表型（高表达SFTPA，SFTPB，SFTPC，NAPSA，TTF-1和KRT）；同一患者脑部肿瘤存在显著的空间异质性；CTC单细胞测序差异表达基因可用于判断未知原发灶来源肿瘤（CUP）的起源部位。此研究结果为肺癌脑转移患者的早期诊断及个体化治疗奠定了坚实的基础。

最后，关教授总结了目前脑肿瘤液体活检的优势、挑战及未来应用前景。他指出CTC检测在诊断软脑膜转移中具有高灵敏度和特异性，而ctDNA可提供基因组谱，指导治疗决策。但常见的CTC检测方法仍无法提供可靠的基因组谱，如何区分ctDNA基因组谱中的“驱动”突变也具有一定挑战性。不可否认的是，未来CTC及ctDNA检测对脑部肿瘤治疗决策仍有重要意义。

刘毅教授

解放军总医院第五医学中心

如何更适合临床的应用-CTC检测的未来之路

刘毅教授是我国最早参与CTC临床研究的科研人员之一，完成了CellSearch中国临床试验中一半以上的CTC检测。刘教授首先以乳腺癌CTC检测为切入点，介绍了目前CTC检测在不同临床场景中的应用价值，包括早期诊断、预后判断、实时监控、疗效追踪及个体化治疗等。随后，刘教授结合自己在CTC检测技术方面的应用经验，系统、全面的介绍了目前多种广泛使用的CTC检测方法，并以FDA批准的CellSearch系统为例，着重分析了此平台的优缺点：规范标准，具有可比性；有充分的循证医学证据。但整体敏感性不足，检出率较低，无法进行后续深入的分子生物学分析等。在此基础上，刘教授提出了诸多改进当前CTC检测效率与准确性的方案，但也表示目前CTC检测的最佳方案仍有待未来的进一步探索。

围绕未来CTC在个体化精准治疗中的作用与价值，刘教授提出了CTC检测的关键性问题：1）CTC的分子分型与疗效预测如何能更好的指导临床？刘毅教授根据自己团队在乳腺癌中的研究经验给出解答。首先评判CTC的阳性标准时，不仅要考虑CTC抗体表达强度，也需考虑这群CTC在群体中所占的比例。若组织学检测时间与CTC检测时间间隔较短，两种检测结果出现不一致情况会较少，反之亦然，这提示实时监测CTC重要性。但由于CTC检测的复杂性，且异质性较强，因此进行CTC单细胞分析具有一定必要性。此外，在保持细胞活性的条件下，创造适合生长的微环境完成CTC的体外培养，进一步确认CTC的表型与功能是未来研究肿瘤转移和耐药机制的必要手段。2）CTC检测技术该如何更好的满足临床治疗的需求？刘教授指出可能需要新颖独特的策略或者几种策略的联合满足更高富集效率；进行CTC表型和功能的鉴定以满足特异性验证策略；尽可能全的捕获整个群体，且能分析单细胞以充分考虑CTC异质性；检测流程简单实用，培养专业的技术人员，制定合理的CTC检测价格使具有可操作性和推广性；全程质控可溯使具有准确性和重复性；任何技术应经过严谨的临床试验来证实以提供循证医学的证据。最后，刘教授指出在未来的临床应用中CTC检测应结合临床需求，寻找最相匹配的检测平台，只有真正解决问题才更有竞争力。毫无疑问，CTC检测的临床应用前景光明，但路途依然遥远。

孙云帆医生（由周恺乾博士代讲）

复旦大学附属中山医院肝肿瘤外科

肝癌CTC临床及单细胞组学研究进展

孙云帆医生提出目前临床CTC检测难以逾越的瓶颈是如何保证CTC检测整体pipeline中各个环节的均一、稳定与高效，而这亦是实现CTC临床价值的关键前提。全球第一个FDA和CFDA批准的CTC检测系统CellSearch平台及现在的科研级CTC检测平台，都由于其自身缺陷极大限制了CTC检测在临床上的应用。为满足未来临床CTC检测需求，孙医生所在的中山肝外科樊嘉院士团队致力于研发第三代CTC技术平台（ChimeraX系统），并与我们分享了该系统现阶段的研究成果。ChimeraX系统整合了三个模块，包括CTC阴性富集和荧光染色，基于人工智能的CTC识别和分析，CTC自动抓取和单细胞测序。ChimeraX系统的性能验证结果显示，该系统能实现更高效的异质性肿瘤细胞的富集，且具有较高的灵敏度及重复性。

在此基础上，樊嘉院士团队利用ChimeraX系统完成了近4000人次的CTC检测，获得了CTC检测在真实世界的研究数据。通过ChimeraX CTC AI图像识别，目前已能够实现CTC的智能判读。在图像识别的过程中，可根据CTC形态学特征进行表型组学分类。他们发现特定的CTC形态与肿瘤临床分期、转移复发和化疗疗效显著相关。回顾性分析不同病理类型的肝癌，ChimeraX系统CTC的检出率均>50%。此外，术前肝细胞癌CTC检测能反映肿瘤负荷，预测肝癌术后复发。术后肝癌CTC动态随访能提前预警转移复发。更值得庆祝的是ChimeraX平台目前已经可以实现CTC的单细胞全基因组测序，从CTC单细胞精确操控，到全基因组扩增，最后到Low-pass全基因组测序。同时，孙医生向我们呈现了自己团队利用ChimeraX平台对肝癌CTC进行转录组测序的研究成果。与原发瘤相比，肝癌CTC中特征性上调的基因主要涉及免疫、迁移侵袭、增殖、抗凋亡等信号通路。而肝癌CTC可通过表达CCL5招募Treg细胞，抑制杀伤性T细胞的活化，是肝癌CTC发生免疫逃逸的关键因素。最后，孙医生在总结时说，临床级CTC技术平台仍是CTC广泛应用于肿瘤精准医疗的关键。未来将CTC计数和CTC单细胞组学分析结合是肿瘤精准诊疗和全病程管理的发展方向。

聚焦ctDNA临床应用最新进展

张新教授

复旦大学附属中山医院呼吸科副主任

支气管冲洗液体活检在肺癌诊断中的价值

张新教授介绍道，靶向治疗已经成为肺癌治疗的重要手段，以前的分子靶标有EGFR和ALK，现在又引入了ROS1、BRAF，各种各样的靶向药层出不穷。而基于驱动基因突变对肿瘤进行分子分型是靶向治疗的基础。但是，在临床实践中，组织活检作为肺癌分子分型的标本存在着耗时长、标本难获得、肿瘤异质性（病理检测假阴性）等局限性，因此探索新的可以用于基因检测的快速、准确的临床标本非常重要。支气管冲洗液（BWF）就是这样一类标本，它有着DNA质量高、浓度高、能反映肿瘤异质性等优势，可以弥补活检肿瘤组织不足的情况。

因此，张新教授的团队在中山医院展开了BWF的单中心研究，将BWF检测结果和支气管镜活检或其他方法诊断的结果进行对比，发现BWF作为样本进行EGFR检测，可以获得不亚于支气管活检组织基因检测的结果，甚至具有更高的敏感性（92.5% vs. 77.5%）。在一则案例中，张新教授仅在患者的BWF中检测到了EGFR-L861Q突变，但未在组织中检测出。基于该突变结果，患者使用阿法替尼进行靶向治疗，肿瘤得到了有效控制，患者至今仍然存活。相比于组织学标本平均的11.8天的检测周期，BWF平均为2天，更加快速。张新教授还研究了影响BWF检测效率的因素，发现病灶性质、冲洗时间、病灶接触等级、冲洗液回收量等因素会影响检测的效率。

在此基础之上，张新教授进一步开展了多中心、盲法的前瞻性研究，对比支气管冲洗液与活检组织、血液样本对肺癌EGFR等基因突变检测的价值。研究结果显示BWF中cfDNA的浓度大大高于血液，DNA片段的分布也比血液中更广。而大panel基因检测的结果显示，BWF上清用于基因检测和组织的一致率要高于沉渣（87.1% vs. 76.2%）。对于肿瘤驱动基因，一致率还会得到进一步的提升（96.1%vs. 86.8%）。此外，BWF上清还可用于检测CNV。因此，张新教授认为支气管冲洗液和组织样本相互补充，能够更好地实现肺癌患者的个体化治疗，并总结了支气管冲洗液可能的应用场景：与活检组织平行检测、不适合活检时的替代、TKI耐药后的二次活检、辅助鉴别诊断、免疫治疗标记物。

史颖弘教授

复旦大学附属中山医院肝外科副主任

ctDNA在肝癌诊断和复发监测中的临床应用

史颖弘教授首先回顾了肝癌的流行病学特点。虽然肝癌目前全球发病率排在第六位，但是死亡率排在了第四位。而中国新发肝癌占全球55%，5年生存率仅为7-14%。早诊早治、抗转移复发依然是提高肝癌患者总体生存的关键。应对肝癌根治术后高复发转移率，还需要解决两大问题：缺乏有效的预警手段、缺乏明确有效的预防复发手段，利用肿瘤生物信息学的精准医学手段可能是解决上述问题的关键。肿瘤液体活检就是一项重要的精准医学手段，包括了CTC、ctDNA、miRNA、外泌体等，优势在于微创、敏感、实时，可以进行动态监测、早期预警、作为组织的补充。相对其他的液体活检标志物，ctDNA有着独特的优势，包括样本量足、时空稳定性好。研究显示，ctDNA能够指导分子分型、精准反映肿瘤进程、提前预警肿瘤复发、发现耐药机制。

正是由于这些优点，史颖弘教授所在的中山肝外科樊嘉院士团队探索了ctDNA在肝癌早期诊断和复发监测方面的价值。在肝癌早期诊断方面，樊嘉院士团队研究了cfDNA的表观遗传学修饰现象—胞嘧啶的5-羟甲基化（5hmC），血液cfDNA上5hmC分布特征能够反映体内癌症的特征。通过和芝加哥大学何川教授的合作，樊嘉院士团队利用化学标记法捕获了cfDNA中含5hmC的基因片段，并通过2861例患者的多中心临床试验，成功建立了5hmC的肝癌诊断模型。该模型判别肝癌和健康对照、乙肝对照的AUC分别达到了94.5%和89.5%，可以用于高危人群的肝癌早期检测。

在复发监测方面，史颖弘教授对47位肝癌病人手术前后的癌症相关基因突变进行了检测和对比分析。检测结果显示，ctDNA能够检测到47个肿瘤相关基因突变，而组织检测到98个，同时检测到的为25个。这25个突变基因可以作为后续监控的靶标，而TP53和CTNNB1则是肝癌病人ctDNA中检出突变频率最高的两个基因。手术前后ctDNA对比发现突变频率有4种变化模式：1）大幅降低，2）低频突变变化，3）基本无变化，4）极少数突变频率上升。其中50%的病人是术后ctDNA数量及频率有显著降低或消失，提示手术成功或者治疗效果良好。史颖弘教授认为，通过延长采血周期或跟踪随访，利用ctDNA检测对病人术后疗效或复发进行监测，临床意义巨大。

关注液体活检临床检测的质量控制

李冬教授

同济大学附属同济医院检验科主任

外泌体检测的应用及质量控制

李冬教授分析了精准医疗时代组织样本存在着无法获得、具有组织异质性、时空异质性的困境，说明了外泌体等液体活检标志物的出现是肿瘤学科升级的必然产物，并简明扼要地对外泌体进行了介绍。外泌体作为一种具有生物功能的膜结构，既是细胞间信号物质传递的方式，也是疾病的标志物，还可以作为疫苗或药物的运输载体。单单是临床检验方面的潜在应用，就涵盖了用药指导、辅助诊断、早期筛查、预后评估、疗效监测等多个方面。因此，国家大力支持外泌体方向的研究，2019年国家自然科学基金提供了2.54亿元的经费资助，较2018年增加了44.5%。虽然外泌体具有着巨大的潜力，但是李冬教授指出，其用于肿瘤临床检测尚存在应用标准化等问题，引发了众多临床工作者的关注。李冬教授按照分析前、分析中、分析后三个部分，详细介绍了如何通过规范化的操作实现外泌体检测的质量控制。

外泌体检测的样本类型包括了血清、血浆、细胞培养上清液、脑脊液、尿液、唾液、鼻腔分泌液、乳汁。分析前，需要根据不同的应用选择不同的样本，如血清适合研究血小板相关疾病，而血浆适合绝大多数外泌体检测。同时，不同的样本在采样时有着不同的注意事项，如脑脊液需要避免血液污染，而尿液则需要新鲜采集和避免细菌污染。在正确采样的基础上还需要选择合适的外泌体分离方法。李冬教授剖析了多种外泌体分离方法的特点，应用最广泛的超高速差速离心法操作复杂，密度梯度离心法纯度更高操作也更复杂，聚合物沉淀法产率高但污染多，免疫亲合法纯度高产率低。目前还没有高回收率、高特异性的外泌体分离方法，因此需要根据检测项目的实际情况确定外泌体的分离方法，分离出的外泌体还需要低温分装保存。外泌体分析中的质量控制主要关注外泌体的鉴定，常用的鉴定手段包括了免疫印迹、纳米颗粒跟踪分析、流式细胞术。在免疫印迹鉴定时，需要包括1个跨膜蛋白、1个细胞内源性蛋白、1个不该存在的内质网来源蛋白。在鉴定过程中，需要严格控制仪器和人员的质量，还可以通过商品化的“标准品”加强质控，但目前仍缺乏商品化的阳性质控品。而完整的原始实验记录和对标准操作程序的严格遵守则为外泌体分析后质量控制把好了最后一关。

郭玮教授

复旦大学附属中山医院检验科主任

ctDNA检测的全面质量管理

郭玮教授开门见山地向我们呈现了ctDNA领域最新的临床研究成果。NILE研究首次表明，在非小细胞肺癌中，液体活检可以替代常规活检进行分子分型，甚至可能是无法获得组织样本的患者的唯一选择。TARGET研究则显示，在多种晚期癌症中，FFPE样本无法体现肿瘤的持续进化，需要ctDNA指导肿瘤靶向治疗，发现获得性耐药突变。聚焦于ctDNA临床价值的目光也越来越多，近3年ClinicalTrial网站注册的ctDNA相关研究高达95项，远高于CTC的52项和外泌体的15项，研究内容包括了伴随诊断、复发监测、筛查诊断、预后评估等肿瘤治疗的全过程。这一切都表明，临床肿瘤精准治疗进入了ctDNA的时代。

郭玮教授指出，检验科需要跟上临床的步伐，提供准确的ctDNA结果给到临床。而实现这一目标，需要从建立方法的质量管理、开展检测全过程的质量控制和临床有效性实用性验证三方面进行全程的质量管理。郭玮教授尤其强调，临床检测不同于科学研究，样本一般只检测一次，所以首先要全方位的保证检测体系足够稳健和准确-也就是分析有效性。建立方法的质量管理不光包括了方法学的优化，更重要的是规范的设项流程，从空间、人员、物料全方位为ctDNA的精准检测提供条件。郭玮教授基于中山医院检验科的经验，总结了ctDNA检测的全程质量控制要点，同时强调要和临床医生充分沟通保证临床有效性和临床实用性。

精准肿瘤学时代，ctDNA检测在肿瘤临床研究与实践中发挥着越来越重要的作用，ctDNA检测的全面质量控制将是实现临床有效性及实用性的基石与前提。