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科学家是怎么证明的？中性粒细胞是乳腺癌转移的帮凶！

2016年01月03日

编译作者：Zoe Zhang &KK

有报道显示，在肿瘤存在的情况下，远端靶部位白细胞组分发生亚临床变化有助于转移瘤的生长。肿瘤内的癌细胞具有异质性并保留有不同的肿瘤分化潜能。然而，转移起始细胞(metastasis-initiating cells, MICs)依赖于适宜的微环境才能在远处灶点顺利生长。因此，作者提出了猜想：远处肿瘤灶的白细胞的改变可能影响了特定亚型的肿瘤细胞传播。为了验证这个假说，研究人员运用肺转移的MMTV-PyMT乳腺癌小鼠模型，这一模型更有利于观测根据其高转移起始能力分类的细胞亚群（CD24+CD90+MICs）。

研究人员发现CD11+Ly6G+中性粒细胞在MMTV-PyMT+肿瘤小鼠中被系统性的动员。尽管它们在原肿瘤微环境中出现的频率很低，它们却是肺转移瘤中主要增加啊的免疫组分。更加值得注意的是，早在癌细胞浸润肺组织之前（pre-metastatic lung），CD11+Ly6G+中性粒细胞已经在肺部聚集,在转移进展过程中（metastatic lung）细胞数目增多。接着，作者通过运用一种粒细胞集落刺激因子（Gcsf）敲除的MMTV-PyMT+肿瘤小鼠（该种小鼠能进展乳腺癌却不能在肺部聚集中性粒细胞）来评估CD11+Ly6G+中性粒细胞的数目与功能的关系。该模型突出的优点在于基因源性的中性粒细胞缺乏能在不影响原发部位肿瘤的前提下，显著缩小自发肺转移瘤。而巨噬细胞在基因敲除小鼠和WT小鼠中无差别。G-CSF的缺失既不改变肺内中性粒细胞的聚集，也不改变肺内转移瘤。为了改变中性粒细胞的基因，实验人员将MMTV-PyMT+背景鼠与中性粒细胞蛋白酶（ Neutrophil elastase, Ela2）Ela2-Cre和ROSA-Flox-STOP-Flox白喉毒素小鼠杂交，获得Ela2-Cre-DTA+小鼠。该基因背景小鼠不影响肺内巨噬细胞、循环骨髓细胞、NK细胞以及细胞毒性T细胞的变化。结果发现:这种选择性敲除的小鼠在不影响原发肿瘤生长的前提下，抑制了肿瘤的转移过程。

如前所述，CD11+Ly6G+是肿瘤浸润之前先于肿瘤出现的中性粒细胞。通过对比肿瘤刺激下产生的CD11+Ly6G+细胞以及健康肺中的中性粒细胞，其差异非常小。表现在肿瘤诱导中性粒细胞形态上更为成熟，接近于健康肺中的中性粒细胞，同时，CD31表达升高提示肺穿透力更强。为了进一步探讨肺中性粒细胞对转移的作用是否并非依赖于其潜在的免疫抑制作用，作者又采用了一种免疫缺陷小鼠（Rag1-null），并采用时间依懒性中性粒细胞（anti-Ly6G 抗体）抑制剂，在预转移模型中，转移过程敲除中性粒细胞能降低自发转移。（Fig 1h-j,l）

Fig 1.中性粒细胞在浸润预转移肺且促进转移过程

研究人员接下来探究了中性粒细胞分泌因子对肿瘤细胞潜在的直接作用。采用癌细胞浸润前的肺组织内中性粒细胞作为培养媒介（ Pre-metastatic lung neutrophils culture medium , LuN medium）来培养原代MMTV-PyMT肿瘤细胞（非贴壁培养），这些细胞表现为更立体的生长模式。而短暂的LuN medium贴壁培养后，无论在体还是离体模式下，癌细胞爆发出更强致瘤潜能。更为重要的是，短暂LuN medium暴露后，全部癌细胞的转移潜能都提高了。

癌细胞的异质性在其传播及定植的环境中被激发出来。因此研究者试图探究中性粒细胞分泌因子是否影响了高度转移性细胞的相对数量。研究人员将MIC暴露于LuN medium或与新鲜分离的预转移灶中的中性粒，结果发现两种暴露环境中，MIC（CD24+CD90+）的数量加倍。以上研究结果表明MICs促进中性粒细胞源性的因子改变癌细胞的异质性，导致所有癌症细胞转移能力的提高。（Fig 2j）

Fig 2.中性粒细胞来源的信号促进了肿瘤发生，提高了转移细胞数量

那究竟是哪种中性粒细胞分泌因子介导了上述活性呢？肿瘤微环境能分泌诸多包括CCL2，MMP9，IL-6及IL-1Z在内的免疫反应细胞并能增加肿瘤发生的过程。因此作者不再关注固有的中性粒细胞分泌因子。而是检测到高表达的一系列Alox5酶的产物：脂类白三烯B4（LTB4）半胱氨酸白三烯C4,D4和E4(LTC/D/E4)，在白三烯直接刺激下，即可诱导空间生长，而3天时间的短暂暴露LT即可增强癌细胞的肿瘤发生潜能。且在所有MMTV-PyMT肿瘤细胞和其他已知的乳腺癌细胞系的MICs上高度表达LT受体（LTRs；LTB4受体2（BLT2）以及LTC/E/D4受体2（CysLT2））。并且和中性粒细胞分泌的因子相似，MMTV-PyMT肿瘤细胞在3天体外LT刺激下，能提高体内MIC的数量和转移起始能力。

在LTB4信号通路中，通过增加细胞外信号调节激酶（ERK）1和2的磷酸化水平，肿瘤细胞受LTB4及LTC/D/E4调节。LTR+则通过LT依赖性磷酸化ERK1/2（pERK1/2）增加且一直BLT2及CysLT2影响ERK1/2。而3天的LTC/D/E4暴露则可以增加LTR在肿瘤细胞的密度。总而言之，LT选择性的增加在MAPK/ERK激酶（MEK）1和2介导的，pERK1/2依赖行为中MICs的增殖能力。以上结果可以提示，LTs提供了一个肿瘤细胞固有的选择性的高增殖能力（Fig 3）

Fig 3.LTs促进MICs增殖，促进肿瘤发生

为了确认LTs在上述过程中的相关性，研究人员又采用了一种Alox-5敲除的小鼠。这种小鼠不改变原发肿瘤的生长以及中性粒细胞在肺部的聚集，然而自发转移过程却是受到限制的。而用上述方法制备Alox-5敲除的小鼠的LuN (LuN-Alox5ko) medium,相同模式下给予3天预处理，MMTV-PyMT肿瘤细胞的转移潜能却没有提高。用Zil（zileuton，Alox5特异抑制剂）阻断LT产生，也能达到相同的抑制转移发生的效果（体内，体外）。（Fig 4）

Fig 4. 阻断Alox5减少了肺转移的发生

参考文献：Wculek, S.K. and I. Malanchi, Neutrophils support lung colonization of metastasis-initiating

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