该项成果于2017-6-12在线发表在《Clin Cancer Res》上，提示Cellsearch捕获CSFCTCs诊断肺癌脑膜转移远远优于传统方法；同一患者的脑脊液循环肿瘤细胞远高于外周血循环肿瘤细胞，提示可能前者更能代表颅内的肿瘤负荷状态。首次对脑脊液循环肿瘤细胞进行二代测序，证实CSFCTCs的基因状态与原发灶高度一致，提示CSFCTCs可能是脑膜转移液体活检的重要方式。EGFR T790M在脑脊液循环肿瘤细胞的检出率远低于颅外病灶，提示可能存在其他的耐药机制。
脑膜转移诊断标准是影像学典型表现或脑脊液病理细胞学找到典型肿瘤细胞，然而传统方法头颅MRI特异性差，而脑脊液液基细胞学技术特异性高，但其敏感性仅约50%(第一次腰椎穿刺术时)，影响了临床中脑膜转移的早期诊断与早期干预治疗[1-4]。
Cellsearch技术通过带抗EpCAM的磁珠来富集上皮细胞，应用于捕获外周循血环肿瘤细胞（circulating tumor cells,CTCs），应用于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等多个恶性肿瘤的随访、疗效预测及预后[5-9]。近年有学者将其改造并应用于捕获实体瘤脑膜转移脑脊液肿瘤细胞（cerebrospinal fluid circulating tumor cells，CSFCTCs）[10-12]，提示CSFCTCs可显著提高脑脊液中肿瘤细胞的检测率，其敏感性可高达90%以上。而在肺癌脑膜转移中，CSFCTCs能否作为“液体活检”的一种方式来反映颅内转移灶特别是脑膜转移灶耐药机制尚未见报道。
从2014年6月至2016年5月共纳入21例患者，所有患者均接受头颅MRI增强检查及腰椎穿刺术留取脑脊液同时行液基细胞学病理评估及cellsearch系统捕获脑脊液循环肿瘤细胞。对捕获到的脑脊液肿瘤细胞行二代测序。
结果
脑膜转移患者临床特征
所有患者都是中国人，都是病理确诊的肺腺癌；中位年龄是53岁（32-76岁），其中10个是男性。95%的患者诊断为IV期肺癌，76.2%患者的ECOG PS评分 > 1分.头晕和头痛是最常见的神经症状，14例患者同时伴有脑转移。见表1.
图一. CTCs and CSFCTCs captured by Cellsearch.
表1. 21例脑膜转移患者的临床特征
三种诊断方法的敏感性与特异性
脑膜转移的诊断标准是典型的头颅MRI表现或TCT或Cellsearch法在脑脊液里找到肿瘤细胞，21例患者均诊断为脑膜转移（见表2）。Cellsearch法诊断的敏感性是95.2%，而TCT、MRI、MRI与TCT联合的敏感性分别是57.1%, 47.6%, 90.5%. Cellsearch法诊断的特异性是100%。
表2 三种脑膜转移诊断方法的敏感性与特异性
CSFCTCs ,CTCs, MR及TCT的关系
20例患者捕获到CSFCTCs (中位数为969 CSFCTCs/7.5 mL; 27–14,888 CSFCTCs/7.5 mL), 而14例患者的外周血仅5例检测到CTCs (中位数为2 CTCs/7.5 mL; range, 2–4 CTCs/7.5 mL)；颅外的外周循环肿瘤细胞数目远低于颅内的脑脊液循环肿瘤细胞，提示外周血CTCs是不能代表颅内情况的，可能CSFCTCs更能代表颅内肿瘤负荷。21例患者里，12例患者脑脊液TCT找到肿瘤细胞, 共10例患者在MRI上有典型表现 (见图2)。脑脊液TCT的检出率与cellsearch捕获到的脑脊液循环肿瘤细胞数目并无相关关系。有意思的是，11例患者有持续神经症状但在头颅MRI上并无典型脑膜转移表现，而在脑脊液里都找到了肿瘤细胞而确诊脑膜转移。2例患者 (patient 6及patient 15) 在头颅MRI及 TCT都是阴性, 但cellsearch系统捕获到了CSFCTCs (见图2-2)，且在CSFCTCs 里patient 6检测到EGFR L858R突变而patient 15相应地检测到EGFR del 19缺失(见表2-3). 而在10例有典型MRI表现的患者中，有7例患者在TCT的结果是阴性的，然而其中6例都检测到了CSFCTCs(见图2)，相应的驱动基因都能在CSFCTCs检测到(见表3)。
图2 CSFCTCs ,CTCs, TCT, MRI的关系
Abbreviations: CSFCTCs, cerebrospinal fluid circulating tumor cells; CTCs, circulating tumor cells; TCT, Thinprep cytologic test; MRI,brain magnetic resonance imaging; LM, Leptomeningeal metastases; UA, unavailable.
CSFCTCs的基因谱
原发灶及CSFCTCs基因谱的比较见表3。原发灶和再活检病灶是临床常规检测的，而19例CSFCTCs是用二代测序检测的， CSFCTCs的基因状态与原发灶高度一致(17/19, 89.5%,见表3)。大多数患者的脑脊液活检与再活检同时进行，少数患者再活检后进行了干预，见表3。其中的16例患者在EGFR/ALK抑制剂治疗期间发生脑膜转移，9例患者中的7例在颅外病灶检测EGFR基因常见耐药突变EGFR T790M, 然而在CSFCTCs中，14例患者检测EGFR常见突变， 仅一例患者检测EGFR T790M (patient 2, 表3, 图3A). 而在CSFCTCs中检测到其他的潜在耐药基因，包括MET扩增同时在EML4-ALK 重排的patient 3 和EGFR del19的patient 14 中检测到，而PIK3CA exon2 N107S 及MET exon11 F839L 同时在携带EGFR L858R 突变的patient 18 中检测到(图3B)，ERBB2 exon8 T328fs及 ROS1 exon7 W215X 同时在携带EGFR del19缺失的patient 9 中检测到.
表3 19例患者的原发灶与脑脊液肿瘤细胞的基因谱
图3. 个案报道
讨论与点评
脑膜转移的诊断依赖于头颅MRI的典型表现或是TCT阳性，然而这两个传统的诊断方法均存在不足。在本研究中，将cellsearch技术应用于捕获脑脊液肿瘤细胞，结果显示CSFCTCs的敏感性显著优于MRI及TCT，且捕获到的CSFCTCs行二代测序显示与原发灶驱动基因高度一致，提示CSFCTCs在脑膜转移中“液体活检”的潜在作用。
Cellsearch技术捕获外周血CTCs已广泛应用于肺癌、乳腺癌、前列癌、直肠癌等多种肿瘤的随访与预后监测[5-8] ，其主要是识别肿瘤细胞的EpCAM抗原而进一步识别并分离肿瘤细胞，而将其改造并应用于捕获脑脊液循环肿瘤细胞近年来引起了越来越多的关注[11-14]。在本研究中，CSFCTCs的特异性是100% ，敏感性是95.2% ，显著高于传统的MRI及TCT，提示CSFCTCs作为脑膜转移的诊断方式具有更大的优势。CSFCTCs更加优越的敏感性可以解释如下[12][11]: Cellsearch通过EpCAM抗体可识别脑脊液肿瘤细胞上的EpCAM抗原，显著地提高了敏感性；且Cellsearch系统采用的是半自动的诊断方法(CK+/DAPI+/CD45−)，而传统的TCT更多的依赖病理医师的丰富经验。随着靶向药物的广泛应用，晚期NSCLC患者的生存期已显著延长，而脑膜转移患者的预后仍不理想[15, 16]，早期识别并诊断，有助于早期干预，而 CSFCTCs在期间发挥了重要作用。
本研究首次证实同一个患者的CTCs数量上显著低于CSFCTCs，提示CSFCTCs可能更能代表脑膜转移的颅内疾病状态。这可能由以下观点解释[17-19]:首先IV期患者外周血CTCs本来就不高；且CTCs的上皮特征高度异质性，包括EpCAM抗原的表达，而Cellsearch 有可能漏诊EpCAM阴性CTCs。其次，上皮细胞是高度多变且迁移性的，可以在肿瘤发展与修复过程发生向间叶细胞特性发展[17-19]；肿瘤细胞侵犯柔脑膜后会脱落至脑脊液中，循环并进一步分化增殖，而血脑屏障的存在这些肿瘤细胞极少进入血循环中，故CTCs 可能并不能反映颅内的真实情况。
精准治疗时代，NSCLC患者再活检对靶向治疗是极其重要的，特别是肺靶病灶稳定而出现颅内进展的患者，因其安全简单易得，脑脊液活检在肿瘤的驱动基因及耐药基因的检测中发挥了重要的作用[10, 22, 23]。在我们既往报道中发现，脑膜转移更常见于EGFR突变的患者[10, 22, 23]，故本研究更多地关注EGFR突变阳性的非小细胞肺癌患者，以期有更多的探索与发现。EGFR T790M 是第一代EGFR-TKI的最常见耐药突变[24]，然而在本研究中，9例患者中的7例在颅外病灶检测EGFR基因常见耐药突变EGFR T790M, 然而在CSFCTCs中，14例患者检测EGFR常见突变， 仅一例患者检测EGFR T790M，这与既往小样本研究发现EGFR T790M在CNS 病灶或CSF cfDNA 比颅外病灶更少见是一致的[25-29]。这可能是颅内EGFR-TKI低及T790M的空间异质性相关[29-32] ，T790M阴性的肿瘤细胞可出现更强的侵袭性及发生远处转移[28][28]，提示脑膜转移有可能存在其他发生机制. 其他的耐药基因同样在CSFCTCs 检测到：包括检测到MET扩增同时在EML4-ALK 重排的patient 3 和EGFR del19的patient 14 中，而检测到PIK3CA exon2 N107S 及MET exon11 F839L 同时在携带EGFR L858R 突变的patient 18，检测到ERBB2 exon8 T328fs及 ROS1 exon7 W215X 同时在携带EGFR del19缺失的patient 9。然而这些突变与脑膜转移的发生是否存在直接驱动作用仍需要更多的研究证实。此外，Cellsearch通过EpCAM抗体可识别脑脊液肿瘤细胞上的EpCAM抗原而识别并分离CSFCTCs，本研究中对这些CSFCTCs进行二代测序，有可能会漏掉一些EpCAM阴性的肿瘤细胞，而这也是有可能的，因肺癌患者的EpCAM变换多样；同样漏掉的EpCAM阴性的CTCs有可能携带着其他的遗传信息，有可能携带其他耐药或驱动基因，这需要更多的研究进一步验证。
总的来说，cellsearch捕获脑脊液循环肿瘤细胞诊断肺癌脑膜转移远远优于传统方法；同一患者的脑脊液循环肿瘤细胞远高于外周血循环肿瘤细胞，提示可能前者更能代表颅内的肿瘤负荷状态。本研究首次对脑脊液循环肿瘤细胞进行二代测序，证实CSFCTCs的基因状态与原发灶高度一致，提示CSFCTCs可能是脑膜转移液体活检的重要方式。EGFR T790M在脑脊液循环肿瘤细胞的检出率远低于颅外病灶，提示可能存在其他的耐药机制。
本文编译：广东省肺癌研究所 黎扬斯 江本元
Jiang BY*, Li YS*, Guo WB*, Zhang XC, Chen Z, Su J, Zhong W, Yang XN, Yang J, Shao YW, Huang B, Liu YH, Zhou Q, Tu HY, Chen HJ, Wang Z, Xu C, Wang BC, Wu SY, Gao CY, Zhang X, Wu YL. Detection of Driver and Resistance Mutations in Leptomeningeal Metastases of NSCLC by Next-Generation Sequencing of Cerebrospinal Fluid Circulating Tumor Cells. Clin Cancer Res. 2017 Jun 12. pii: clincanres.0047.2017. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-17-0047. [Epub ahead of print]
Li YS, Jiang BY, Yang JJ, et al. Leptomeningeal Metastases in Patients with NSCLC with EGFR Mutations[J]. J Thorac Oncol,2016,11(11):1962-1969.
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