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【JMC】一种新型PROTAC化合物在乳腺癌治疗中的潜力

09月29日

来源：蛋白质降解技术

近日，来自大阪大学的Takayoshi Suzuki 教授团队在《Journal of Medicinal Chemistry》上发表了一篇题为《A Novel PROTAC G9a/GLP Degrader that Inhibits, Similar to G9a siRNA, the Migration of MCF-7 Breast-Cancer Cells without Affecting Proliferation》的文章。该研究团队开发了一种基于RK-701的新型G9a/GLP PROTAC化合物4，该化合物通过PEG连接子将RK-701与VHL配体偶联，实现了对G9a/GLP的高效、选择性降解，同时继承了RK-701的低毒性特性，解决了传统喹唑啉类G9a/GLP抑制剂和PROTAC的毒性问题。

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图1

组蛋白甲基转移酶G9a（EHMT2）及其同源蛋白G9a样蛋白（GLP，EHMT1）是表观遗传调控网络中的核心分子，二者通过对组蛋白H3第9位赖氨酸（H3K9）的甲基化修饰，进而调控细胞的多种生物学过程。

在癌症研究中，G9a/GLP的异常表达与癌症的发生、发展和转移密切相关。目前已报道的G9a/GLP PROTAC均以喹唑啉类的低毒性抑制剂（如 RK-701）为靶蛋白配体，虽能有效降解G9a/GLP，在多种癌症模型中展现出治疗潜力，但由于喹唑啉骨架的固有毒性，这些 PROTAC仍存在对正常细胞的损伤风险，未能解决传统抑制剂的核心缺陷。

基于此，研究团队以低毒性G9a/GLP抑制剂RK-701为核心，设计并合成了 6种PROTAC候选化合物。通过Western blot分析他们评估了其在MCF-7乳腺癌细胞中对G9a/GLP水平的影响，结果发现化合物4具有更优异的降解活性和理化性质。

图2

图3. 在指定浓度下用各种PROTAC候选药物处理24小时后MCF-7细胞中G9a和GLP水平的蛋白质印迹分析：（a）基于烷基接头的比较1-3;（b）烷基接头基1号和PEG接头基4号的比较;（c）基于PEG接头的比较4-6。

随后，为了全面评估化合物4的降解活性，研究团队开展了剂量依赖性和时间依赖性实验。实验结果显示化合物4对G9a的降解选择性约为GLP的2.9倍；同时，化合物4对G9a和GLP的最大降解率（Dmax）分别达到了89%和71%，展现出高效的降解能力。此外，他们发现化合物4同时具有长效的降解活性，这使其在长期细胞实验和潜在临床应用中具有优势。

图4. MCF-7细胞中G9a/GLP水平的蛋白质印迹检测：（a）一定浓度的化合物4处理24小时后；（b）3μM化合物4处理一定时间后。

接下来，为明确化合物4的降解机制，研究团队开展了一系列实验。首先，他们发现，只有使用化合物4（RK-701与VHL配体的偶联物）处理细胞，才能有效降解靶蛋白，表明靶蛋白配体与E3配体的偶联是降解活性的前提。其次，在竞争结合实验中，证实了化合物4通过RK-701结构域与G9a结合，通过VHL配体结构域与VHL结合，符合PROTAC的双功能结合特性。最后，使用蛋白酶体抑制剂硼替佐米预处理细胞1.5小时后，化合物4诱导的G9a/GLP 降解被完全阻断，证明化合物4通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）实现对G9a/GLP的降解，符合PROTAC的经典作用机制。

图5. 用供试化合物处理的MCF-7细胞中G9a和GLP水平的Western blot检测：（a）用化合物4，RK-701，VHL配体处理24 h，用RK-701和VHL配体共处理;（b）在 RK-701 和 VHL 配体存在下用化合物 4 处理 24 小时;（c）在蛋白酶体抑制剂硼替佐米存在下用化合物4处理22.5小时。用硼替佐米预处理细胞1.5小时，然后加入化合物4。

紧接着，为了验证化合物4的选择性，研究团队对经3 μM化合物4处理24小时的MCF-7细胞进行了全蛋白质组分析，并与传统喹唑啉类PROTAC（MS8709）进行对比。结果证明化合物4具有极高的靶向选择性。与此同时，研究者们进行了细胞活力检测实验，结果证实化合物4继承了RK-701的低毒性特性，解决了传统喹唑啉类PROTAC的毒性问题。

图6.与此同时，他们研究了化合物4对G9a催化活性的抑制作用，结果证明化合物4 有效抑制G9a的催化功能。

图7.化合物4的G9a抑制活性评估：（a）RK-701和化合物 4 体外G9a抑制;（b）蛋白质印迹检测用指定浓度的测试化合物处理的MCF-7细胞中G9a和H3K9me2水平72小时。

最后，为进一步探索化合物4对细胞表型的影响，研究团队对比了其与G9a siRNA的效应。细胞活力实验显示，G9a siRNA（10-50nM）或化合物4（0.1-3μM）处理MCF-7细胞72小时后，均未对细胞增殖产生明显抑制作用；而细胞迁移实验（Transwell实验）则发现，G9a siRNA（50 nM）处理24小时能显著抑制 MCF-7 细胞的迁移能力，化合物4（3μM）的抑制效果更为显著，且优于RK-701。这一结果表明，化合物4能模拟G9a siRNA的表型效应——抑制乳腺癌细胞迁移但不影响增殖，而其抑制迁移的效果更强，可能是因为化合物4通过降解 G9a/GLP，同时阻断了二者的催化功能和非催化功能（如通过锚蛋白重复结构域与其他蛋白的相互作用），而RK-701仅能抑制催化功能。

图8.总体而言，这种新型G9a/GLP PROTAC 化合物4的成功研发，不仅为G9a/GLP靶向调控提供了新的技术范式，推动了表观遗传调控机制的深入研究，也为癌症等疾病的治疗开辟了新的思路。

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