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洛莫司汀和尼莫司汀对获得性替莫唑胺耐药的胶质母细胞瘤模型具有有效的抗肿瘤作用

08月12日

来源：肿瘤资讯

背景：胶质母细胞瘤（GBM）在接受标准替莫唑胺（TMZ）治疗后，几乎不可避免地会产生获得性耐药，导致肿瘤复发。对于TMZ耐药的复发性GBM（TMZ-R-GBM），目前尚无标准治疗方案。亚硝基脲类药物洛莫司汀（CCNU）和尼莫司汀（ACNU）有时被用作挽救治疗，但其确切疗效缺乏充分的临床前证据。

方法：我们通过在TMZ持续处理下长期培养三种人类GBM细胞系（U87, U251, U343），建立了TMZ耐药的细胞模型（TMZ-R-细胞）。随后，我们在体外和体内（小鼠颅内移植瘤模型）系统地比较了TMZ、CCNU和ACNU对这些TMZ-R-细胞及其亲本细胞的抗肿瘤活性。

结果：体外实验证实，与亲本细胞相比，TMZ-R-细胞对TMZ的敏感性显著降低。然而，TMZ-R-细胞对CCNU和ACNU的敏感性与亲本细胞相当，显示出有效的抗肿瘤活性，且不存在交叉耐药性。进一步研究表明，TMZ-R-细胞的耐药机制与DNA损伤修复通路（如错配修复通路）的改变有关。

在体内实验中，对于接种了TMZ-R-细胞的小鼠，CCNU或ACNU治疗均能显著延长其生存期，而TMZ治疗则无效。

结论：本研究提供了强有力的临床前证据，表明亚硝基脲类药物CCNU和ACNU能够有效克服获得性TMZ耐药。这些发现为临床上使用CCNU或ACNU作为TMZ治疗失败后GBM患者的挽救治疗方案提供了坚实的理论基础。

引言

替莫唑胺（TMZ）是胶质母细胞瘤（GBM）一线标准治疗的核心药物。然而，几乎所有患者最终都会出现TMZ耐药并导致肿瘤复发。对于这种TMZ耐药的复发性GBM（TMZ-R-GBM），目前缺乏有效的标准治疗，是导致GBM预后极差的关键原因。

亚硝基脲类药物，如洛莫司汀（CCNU）和尼莫司汀（ACNU），是TMZ问世前用于GBM治疗的烷化剂。在临床实践中，它们有时被经验性地用于TMZ治疗失败后的挽救治疗。然而，它们在TMZ耐药背景下的真实疗效，以及是否存在交叉耐药，一直缺乏系统性的临床前研究验证。

因此，本研究旨在通过建立稳定的获得性TMZ耐药GBM细胞模型，在体外和体内直接比较和验证CCNU和ACNU对TMZ-R-GBM的抗肿瘤作用，为临床应用提供概念验证（proof-of-concept）。

方法

TMZ耐药细胞模型的建立

研究者将三种人类GBM细胞系（U87, U251, U343）在含有相应浓度TMZ的培养基中连续培养超过一年，从而筛选出稳定的TMZ耐药克隆（U87-R, U251-R, U343-R）。

体外抗肿瘤活性评估

细胞增殖实验：采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法，测定不同浓度的TMZ、CCNU和ACNU对亲本细胞和TMZ-R-细胞的IC50值。
细胞死亡实验：采用Hoechst/PI双染法，评估各药物诱导细胞死亡的效率。
凋亡分析：通过Western Blot检测PARP和Caspase-3的剪切，评估凋亡通路是否被激活。

耐药机制探索

通过焦磷酸测序法检测MGMT启动子的甲基化状态。通过Western Blot检测DNA损伤修复通路中关键蛋白（如MMR通路的MSH2/6、NER通路的RAD23A等）的表达水平。

体内疗效验证

将U87亲本细胞或U87-R耐药细胞立体定向注射到裸鼠右侧大脑半球，构建颅内原位移植瘤模型。在肿瘤建立后，将小鼠随机分为四组，分别腹腔注射溶剂对照、TMZ、CCNU或ACNU。主要研究终点为小鼠的总生存期。

结果

CCNU和ACNU在体外有效抑制TMZ耐药细胞

细胞增殖实验显示，与亲本细胞相比，TMZ-R-细胞对TMZ的IC50值显著升高，证实了其耐药表型。然而，TMZ-R-细胞与亲本细胞对CCNU和ACNU的IC50值相似，表明TMZ耐药并未导致对CCNU或ACNU的交叉耐药（图1）。细胞死亡和凋亡实验也证实，CCNU和ACNU能够有效诱导TMZ-R-细胞的凋亡，而TMZ的作用则显著减弱（图2）。

图1

图2

TMZ耐药机制与DNA损伤修复通路改变相关

我们发现，TMZ-R-细胞的耐药并非由MGMT启动子甲基化状态的改变引起。进一步的蛋白表达分析显示，TMZ-R-细胞中出现了DNA损伤修复通路的改变，例如，U87-R细胞中错配修复（MMR）通路关键蛋白（MSH2/6等）的表达下调，而U251-R细胞中MGMT蛋白表达上调。这些改变导致了对TMZ诱导的DNA损伤反应减弱（表现为γ-H2A.X磷酸化水平降低）。

CCNU和ACNU在体内显著延长TMZ耐药肿瘤小鼠的生存期

体内动物实验的结果与体外实验高度一致（图3）：

对于接种U87亲本细胞的小鼠，TMZ、CCNU和ACNU治疗均能显著延长其生存期。

对于接种U87-R耐药细胞的小鼠，只有CCNU和ACNU治疗能显著延长其生存期，而TMZ治疗组与对照组无差异。

讨论与结论

本研究通过构建稳定的TMZ获得性耐药GBM模型，系统地证实了亚硝基脲类药物CCNU和ACNU能够有效克服TMZ耐药。我们的数据清晰地表明，TMZ耐药的产生（例如通过MMR通路缺陷）并不会导致对CCNU或ACNU的交叉耐药。这可能是因为亚硝基脲类药物诱导的DNA损伤类型（如链间交联）与TMZ不同，其修复机制也更为复杂，不完全依赖于MMR通路。

这项研究的核心意义在于，它为临床上在TMZ治疗失败后选择CCNU或ACNU作为挽救治疗提供了强有力的科学依据。无论TMZ耐药的具体分子机制如何（MMR缺陷或MGMT上调等），CCNU和ACNU都显示出可靠的抗肿瘤活性。

综上所述，本研究的数据为利用CCNU或ACNU作为TMZ-R-GBM的挽救治疗候选药物提供了坚实的概念验证，支持了其在临床实践中的合理应用。

参考文献

Yamamuro S, Takahashi M, Satomi K, et al. Lomustine and nimustine exert efficient antitumor effects against glioblastoma models with acquired temozolomide resistance[J]. Cancer Science, 2021, 112(11): 4736-4747.

责任编辑：肿瘤资讯-丹忱
排版编辑：肿瘤资讯-丹忱

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袁景山

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白文秀

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