引言：MET 14号外显子跳跃突变（METex14）是NSCLC相对罕见的致癌驱动因素。近年来，MET抑制剂已被证实可以改善METex14患者预后，已获批相关适应症。然而，不同METex14阳性NSCLC患者对各种治疗反应和预后各异，提示METex14可能存在一定的异质性。为了探索和更好地表征METex14阳性NSCLC患者的异质性，上海市胸科医院研究团队基于超120例METex14阳性NSCLC患者进行了聚类分析，并对不同亚型的生物学和临床意义进行了分析和验证。相关结果已于2024年7月发表于NPJ Precis Oncol杂志（影响因子：6.8），本文对此进行简要解读和分享，希望能为医务工作者提供新的科研和临床参考，造福更多肺癌患者。
背景
METex14是1-3%非小细胞肺癌（NSCLC）的致癌驱动因素，包括肺腺癌（LUAD）和肺鳞癌（LUSC）。METex14阳性NSCLC可对MET酪氨酸激酶抑制剂（MET-TKIs）治疗有反应，报道的客观缓解率（ORR）范围为32%至67.9%，中位无进展生存期（mPFS）为5.4-9.7个月。因此，并非所有METex14阳性NSCLC患者都能从MET抑制剂治疗中获益，METex14阳性NSCLC肿瘤间的异质性可能导致了METex14阳性NSCLC对MET-TKIs反应的差异。
复杂的基因组位置和变异类型是导致METex14阳性NSCLC生物学行为异质性的重要原因。MET基因在METex14阳性NSCLC患者中的表达量也存在差异。据报道，MET过表达的METex14阳性NSCLC从MET抑制剂治疗中获益更多。另一方面，携带METex14的NSCLC患者在转录和蛋白水平上均表现出更高的PD-L1水平，先前的研究也报道了更高的免疫浸润和IFN-γ通路特征。然而，免疫治疗对METex14阳性NSCLC患者的治疗效果仍存争议。上述转化和临床研究均强烈表明METex14阳性NSCLC存在潜在的异质性。
然而，目前尚未有系统研究揭示METex14阳性NSCLC肿瘤间的异质性。为了探索这一可能，需要同时进行全面的基因组和转录组分析，以及肿瘤微环境的免疫表型分析。更好地了解METex14 NSCLC的生物学和肿瘤微环境多样性，可能有助于更准确地评估疾病早期复发的风险，也可能为晚期/转移性METex14 NSCLC患者提供新的治疗方法。
结果
在不同基因组位置MET ex14 NSCLC中只检出了有限的差异表达基因，这表明基因组位置对MET ex14的异质性影响有限。该研究分别对发现队列和验证队列进行了靶向RNA测序，成功率分别为97.67%（126/129）和95.52%（64/67）（图1）。为了了解肿瘤间异质性，利用来自发现队列（n = 126）的RNA-seq数据，对每个样本中KEGG、Reactome、Hallmark通路的富集程度进行了评估，然后进行k-means聚类。根据共识累积分布函数（CDF）和CDF曲线下面积（AUC）的相对变化，本研究首次从发现队列中鉴定出METex14 NSCLC四个亚型（κ = 4）（图1，图2a、b），其中A亚型38例（30.2%），B亚型19例（15.1%），C亚型24例（19.0%），D亚型45例（35.7%）。
图2 对发现队列中METex14 NSCLC进行分类。a 对RNA-seq数据进行无监督聚类分析，共识矩阵展示确定的最佳聚类数（k=4）。b t-SNE图显示了四种NSCLC类别的定位。c 不同分子亚型患者之间临床特征的比较。d 发现队列中四种亚型的无病生存率。森林图展示与DFS相关的分子亚型和临床危险因素的多变量（e）和单变量（f）分析。
A亚型与临床（P=0.0023）或病理（P<0.001）II/III期显著相关，尤其是与临床或病理T2-3（P<0.001）相关（图2c，表1）。亚型A在临床病理学上更具侵袭性，如侵袭性病理亚型（P<0.0001）和胸膜侵袭（P=0.004）（图2c，表1）。在107例接受长期随访的患者中，A和C亚型患者的预后分别最差和最好（图2d，P=0.029）。值得注意的是，C亚型的三年DFS率达到100%（图2d）。多变量和单变量cox回归分析显示，A亚型与较短的DFS独立相关（风险比[HR]=6.68 [95%CI 1.80-24.88]，P=0.005）（图2e，f）。
为了探索亚型特异性基因组特征，研究者对入组患者进行了全面的基因组分析。MET扩增（120个样本中发生率约为5%）在四种亚型之间基本均衡。TP53在A亚型中的突变频率为31.6%，在其他亚型中则相对罕见。无论是在整个队列中还是仅在亚型A中，都没有观察到TP53突变与预后之间的相关性。A亚型中FGF19、AKT2和FGF3扩增发生率明显更高；FGF3、PDCD1和FGF19缺失更常见于B和D亚型。这些CNV的增加/减少与预后、mRNA表达、肿瘤微环境特征、信号通路富集之间没有相关性。在4种亚型中没有发现显著差异的特异性突变特征。在这4种亚型中也没有观察到MET ex14变体基因组位置的分布差异。
METex14的变异等位基因频率（VAF）在A亚型中最高（图3a，P=0.0022），MET基因和c-MET蛋白过表达比例也显著更高（图3b-f，P<0.001）。促进细胞周期、DNA复制和MET驱动的细胞运动以及PTK2信号传导等通路在亚型A中显著富集（图4a-c）。B亚型主要与FGFR通路有关，如PI3K_CASCADE_FGFR1-4以及活化FGFR 1-4的信号传导（图4a，b），其主要特征是FGFR2过表达（图4d）。C亚型的特征是免疫相关通路富集，如MHC_CLASS_II_ANTIGEN、先天免疫系统和适应性免疫系统（图4a，b）。在D亚型中发现了多种信号通路的激活，如NOTCH、FGFR、PIP2、PI3K-AKT、ERBB2和IKBA（图4a、b）。对“NOTCH_SIGNALING_PATHWAY”通路的进一步分析表明，NOTCH4、NOTCH1、CREBBP、MAML2和NCOR2基因高表达（图4e）。
部分METex14 NSCLC患者可受益于免疫检查点抑制剂（ICI）治疗，提示METex14 NSCLC中存在异质性肿瘤微环境。本研究同样发现每种分子亚型都显示出不同的肿瘤微环境（TME）表型（图5a）。A亚型表现出高度免疫抑制性TME，其特征是调节性T（Treg）细胞的浸润和PDCD1（PD-1）的高表达（图5a、b）。同时，在A亚型肿瘤中也可以观察到高度富集的肿瘤相关成纤维细胞（CAF）特征，尤其是全CAF（pCAF）、促结缔组织增生性CAF（dCAF）和LRRC15+ CAF（图5c）。组织学上，H&E染色中密集的促纤维增生表型和纤维化进一步支持了A亚型中CAF特征富集的发现（图5d）。另一方面，C亚型的抗肿瘤免疫表型更为突出，效应细胞、T细胞、Th1特征、B细胞、共激活分子的富集显著增加，炎症性CAF（iCAF）的丰度升高（图5c）。此外，与其他亚型相比，C亚型中STAT、IFN-γ和效应T细胞特征等促炎特征也显著富集（图4e）。值得注意的是，IFN-γ相关基因在C亚型中也高度上调（图4f）。与此同时，多重免疫荧光（mIF）显示A亚型肿瘤组织中CD4+/FOXP3+ Treg细胞聚集（图5g），但在其他三种亚型的肿瘤组织中几乎不可见。与其他三种亚型相比，C亚型有更多的浸润性效应CD8+T细胞，且与PD-L1+肿瘤细胞的空间分布相关（图5h）。在C亚型中也检测到更多的以CD20+ B 细胞为特征的三级淋巴结构（TLS）（图5i）。这些发现表明，在发现队列METex14 NSCLC中，免疫富集亚型患者可能对ICI更为敏感，而A亚型、显著纤维化和Treg浸润的患者则可能对ICI耐药。
为了将本研究发现的METex14 NSCLC的生物多样性转化为临床可用的工具，基于发现队列中的转录组数据构建了一个亚型分类模型（图6a）。研究者纳入了一个独立的复发/转移性NSCLC患者队列（图1），以验证亚型分类模型的性能。为确保生物学可比性，采用t-SNE法分析了发现队列和验证队列患者之间基因表达、肿瘤微环境和信号通路富集的差异。总体而言，在早期和晚期METex14突变NSCLC之间发现了表达谱基本均衡。
简而言之，使用单变量逻辑回归对每种亚型筛选20个主成分基因，共获得80个基因。80个基因中的39个基因进一步通过lasso-logistic回归构建分类模型，还鉴定了亚型特异性基因。5×交叉验证和LOOV分别证实分类模型准确率超过80%（图6b），以及90.5%的LOOV总体一致率（图6c）。基准MET相关信号通路也在预测的亚型A（MET驱动）中富集（68.8%）（图6d），该亚型中MET基因的表达明显更高（图6e）。观察到FGFR相关信号通路在预测的B亚型（FGFR激活）中的富集趋势（图6f），FGFR2基因表达显著上调（图6g）。该验证集中每种亚型的TME表型分析同样显示，预测的C亚型（免疫激活）（21.9%）免疫激活程度更高（图6h）。在预测的D亚型（旁路激活）中同样观察到NOTCH、PI3K-AKT、ERBB2和MAPK的激活（图6i）。
为了了解METex14 NSCLC各亚型的药物敏感性，对独立验证队列中41例接受MET抑制剂治疗的患者生存率进行了分析（图7a）。26例患者为MET驱动型（亚型A），15例患者属于其他亚型。MET驱动型患者与其他三种亚型患者的基线特征具有可比性。随访截止日期为2023年6月，41例患者的mPFS为7.5个月（图7b）。MET驱动型患者对MET抑制剂的反应性更好，并且显示出比其他三种亚型患者更长的PFS（mPFS 9.9个月vs 5.9个月vs 6.3个月vs 4.5个月，P=0.029，图7a、c和d）。此外，MET驱动型与MET抑制剂的获益独立相关（P=0.011，图7f）。然而，MET高表达患者和MET低表达患者的PFS没有显著差异（mPFS 9.6个月vs 7.0个月，P=0.15，图7e）。上述结果表明，MET抑制剂可能更适用于MET驱动型患者。
结论
本研究为METex14 NSCLC肿瘤间分子异质性提供了新的见解，基于转录组数据首次发现了四种不同的分子亚型，其具有独特的生物学和临床意义。本研究的发现有助于METex14 NSCLC患者的精准诊疗。
本文主要参考Chen S, Hu T, Zhao J, et al. Novel molecular subtypes of METex14 non-small cell lung cancer with distinct biological and clinical significance. NPJ Precis Oncol. 2024;8(1):159. Published 2024 Jul 26. doi:10.1038/s41698-024-00642-6。
审批编号CN-143038，过期日期2024-12-18
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