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张蕾教授：具有不同ATP结合模式的BTK抑制剂对BCR信号传导的功能影响各不相同

07月03日

整理：肿瘤资讯

来源：肿瘤资讯

不同BTK抑制剂（BTKi）在ATP结合位点具有不同的效力、选择性特征和结合模式。根据这一特征，BTKi可分为仅占据后口袋（back-pocket）、H3口袋（H3 pocket）和仅占据铰链区域的BTKi。近期一项刊登在Molecule Cancer Therapeutics杂志上的研究报告中，研究者假设不同的结合模式可能会对B细胞受体（BCR）信号通路产生不同的影响，并在体外和体内评估了B细胞淋巴瘤模型中多种BTKi的活性。本文特邀郑州大学第一附属医院张蕾教授针对该文章中关于不同BTKi与ATP结合位点的不同结合模式的内容进行了点评，详情如下。

ATP竞争性BTKi与ATP结合位点的3种不同结合模式

无论是共价还是非共价BTKi，所有经过临床评估的BTKi都可根据其结合模式分为三类：以伊布替尼和非共价BTKi Pirtobrutinib为代表的后口袋粘合剂（back-pocket binders）；以LOU064（remibrutinib）和GDC-0853（fenebrutinib）为代表的H3口袋粘合剂（H3 pocket binders）；以及以ABBV-105（elsubrutinib）为代表的纯铰链粘合剂（hinge-only binders）。迄今为止，所有获批用于肿瘤适应证的BTKi都是共价后口袋粘合剂。利用溶液核磁共振（NMR）和氢氘交换质谱（HDX-MS）进行的详细结构研究表明，各类抑制剂的不同结合模式会对BTK激酶结构域和调节结构域的构象产生不同的影响。

这些ATP竞争性BTKi对BTK PLCγ2 Y1217残基的底物磷酸化的抑制作用也无差别。然而，纯铰链粘合剂在抑制B细胞淋巴瘤下游抗IgM刺激的钙离子通量方面表现出不足。与后口袋和H3口袋粘合剂相比，纯铰链粘合剂对钙离子通量的不完全抑制导致了其在体外和体内抑制肿瘤细胞生长的功效较低。

研究人员采用了X射线晶体学、溶液NMR和HDX-MS方法来探讨抑制剂结合对全长BTK动态构象的影响。Joseph及其同事的研究中检测的纯铰链粘合剂诱导激酶结构域N-lobe发生了有限的构象变化。H3口袋粘合剂GDC-0853改变了BTK激酶结构域N-lobe和C-lobe的构象，但没有影响其调节结构域的构象。相反，与其他BTKi相比，后口袋粘合剂伊布替尼使激酶结构域的αC -helix明显稳定在非活性构象中，并释放了部分激酶结构域远端的SH2和SH3结构域。这些结构特征除了影响BTK的催化活性外，还可能影响其骨架蛋白作用（scaffolding function）。本研究中，纯铰链粘合剂与BTK ATP结合位点的相互作用最为有限，对BTK激酶结构域外的结构构象的影响也最小，因此在所研究的三种类型的BTKi中，纯铰链粘合剂在体外和体内抑制钙动员和肿瘤细胞生长的效力最低。这些结果表明，要破坏BTK的非催化功能并完全抑制其下游信号传导，需要对BTK激酶结构域和潜在的调节结构域构象进行更广泛的干扰。

此外，Phelan及其同事的研究还描述了一种多组分BCR/toll样受体（TLR）信号复合物，该复合物在对伊布替尼敏感的DLBCL ABC亚型细胞系中形成并在内质网膜上发出信号。研究表明，伊布替尼能破坏PLCγ2与MyD88-TLR9-BCR超级复合物中MyD88的相互作用，这表明除了抑制BTK的激酶活性外，后口袋粘合剂还能改变BTK与其多蛋白复合物中信号伴侣（signaling partners）的相互作用。

H3口袋粘合剂的独特特征在于它能够显著抑制上游激酶对Y551的磷酸化。这表现在抑制剂结合后Y551残基侧链旋转异构体的变化，侧链被封闭在H3口袋中，从而无法被磷酸化。然而，虽然Y551残基已被证明能介导Fc受体信号转导，但目前还不清楚恶性B细胞中Y551残基的磷酸化会导致什么功能性后果。

尽管BTK激酶活性被完全抑制，但本研究数据表明，BCR刺激时对PLCγ2激活的不完全抑制是纯铰链粘合剂功能缺陷的主要潜在机制。所有BTKi对PLCγ2磷酸化的抑制程度相同，但对PLCγ2活化的抑制程度却不同，这表现在BTKi处理时观察到的磷酸肌醇产生的不同程度的减少。研究人员推测，在BTK激酶抑制的条件下，RAC2介导的PLCγ2激活可能成为这些细胞中细胞内钙动员的潜在旁路机制（bypass mechanism）。为此，在TMD8细胞中敲除RAC2提高了所有类型BTKi抑制钙通量的效力，并弥补了一些纯铰链粘合剂的缺陷，从而证实了RAC2在BCR耦合钙信号转导中的作用。PLCγ2-激活突变常见于伊布替尼耐药的CLL患者中，RAC2被确定为DLBCL ABC亚型细胞系中伊布替尼耐药的表观遗传介质。在Shaffer及其同事的研究中，与亲代细胞相比，伊布替尼耐药细胞池更依赖于RAC2。此外，定量质谱分析表明RAC2与BTK相互作用。BTK的CRISPR敲除对伊布替尼耐药细胞具有毒性，这表明耐药细胞仍然依赖BTK非催化性功能生存。这些数据进一步支持了PLCγ2和RAC2可能成为克服B细胞恶性肿瘤中BTKi耐药性的潜在治疗靶点。

在既往发表的研究结果的基础上，本研究进一步证明了催化抑制的BTK可与RAC2协调激活PLCγ2，从而确立了RAC2/PLCγ2介导的BTK骨架蛋白作用是BTK激酶活性缺失时BCR信号转导的旁路机制。RAC2基因敲除提高了所有BTKi对钙离子通量的抑制效力和最大抑制率；然而，对于纯铰链粘合剂，仅敲除RAC2并不能完全弥补对钙离子通量的抑制缺陷。这些数据表明，在BTK激酶活性受到抑制的同时，还存在其他能够激活PLCγ2的旁路机制。本研究还显示Akt介导的信号传导升高可能进一步导致纯铰链粘合剂在抑制TMD8增殖方面的效力减弱。最近的一项研究表明，激酶死亡的BTK突变体可以募集造血细胞激酶（HCK）磷酸化并激活PLCγ2，从而在缺乏BTK激酶活性的情况下传递BCR信号。然而，研究人员在用三种类型的BTKi处理时没有观察到HCK磷酸化的变化，这表明HCK介导的BCR信号转导可能与肿瘤细胞中功能增益的BTK C481F或C481Y激酶致死突变体特别相关。

有趣的是，用浓度不断增加的纯铰链粘合剂（ABBV-105）处理TMD8细胞所诱导的耐药性也使该肿瘤细胞系对后口袋粘合剂和H3口袋粘合剂产生部分耐药性。这些结果表明，在对BTKi治疗产生获得性耐药性的情况下，具有不同结合模式的BTKi易受常见旁路机制的影响，当BTK激酶活性被完全抑制时，这些旁路机制可维持癌细胞的增殖。这种耐药性不太可能通过替换不同的催化抑制剂来克服。

总之，本研究证明，虽然后口袋和H3口袋粘合剂抑制了BTK的催化活性和骨架蛋白作用，导致体外和体内癌细胞增殖减少，但纯铰链粘合剂不影响BTK的骨架蛋白作用，也不能抑制肿瘤生长。上述数据表明，在BTK介导的疾病模型中，BTKi对BTK信号转导和疗效有不同的下游影响，并支持在设计和评估用于治疗人类疾病的BTKi时考虑结合模式。

图片1.png 图2.用于研究BTKi对BCR信号通路的不同功能影响的各种检测读数示意图

大咖点评

张蕾

博士、博士后、主任医师、教授、硕士生导师

郑州大学第一附属医院肿瘤科副主任，淋巴瘤病区主任
河南省淋巴瘤诊疗中心副主任
中国女医师协会临床血液淋巴专业委员会常委
中国老年肿瘤学会淋巴血液分会委员
中国抗癌协会血液病转化医学专业委员会委员
河南省研究型医院学会淋巴瘤专业委员会主任委员
河南省医师协会肿瘤医师分会副会长
河南省抗癌协会肿瘤临床化疗专业委员会副主委
河南省医学会肿瘤医学专科学会淋巴瘤学组副组长
中国肿瘤防治联盟淋巴瘤专业委员会常务委员
河南省抗癌协会老年肿瘤专业委员会常务委员

张蕾教授：BCR信号通路参与B细胞的正常生长、发育、分化等过程，BTK是BCR信号通路中的关键激酶，传递BCR接受到的信息并调控B细胞增殖和存活。近年来，ATP竞争性BTKi已成为多种肿瘤的标准治疗药物，并在多种自身免疫性疾病中显示出令人鼓舞的临床活性。这项研究探索了ATP竞争性BTKi与ATP结合位点的3种不同结合模式，所有这些模式均能有效抑制BTK-Y223自磷酸化。

本研究结果表明，虽然所有三种类型的BTKi都能有效抑制BTK-Y223自磷酸化和PLCγ2 Y1217转磷酸化，但只有纯铰链粘合剂在抑制BCR激活后BTK介导的钙动员方面存在缺陷。此外，PLCγ2的活化能被后口袋和H3口袋粘合剂有效阻断，但不能被纯铰链粘合剂阻断。利用缺失RAC2的TMD8细胞进行的进一步研究表明，RAC2起着旁路机制的作用，当BTK激酶活性被纯铰链粘合剂完全抑制时，RAC2仍能发挥残余BCR信号转导和PLCγ2激活的作用。

总体而言，该研究探索了用不同类型的BTKi治疗是否会对BTK下游信号转导产生不同的功能影响，以及在B细胞淋巴瘤模型中的活性程度。并揭示了BTK的激酶活性非依赖性功能，涉及RAC2在BCR信号转导过程中的作用，为选择B细胞淋巴瘤适应证的临床候选药物提供了机理依据。

参考文献

Li W, Sano R, Apatira M, et al. Bruton's Tyrosine Kinase Inhibitors with Distinct Binding Modes Reveal Differential Functional Impact on B-Cell Receptor Signaling[J]. Molecular Cancer Therapeutics, 2024, 23(1): 35-46.

责任编辑：Amiee
排版编辑：guangli

07月04日

李国君

冀中能源峰峰集团有限公司总医院 | 血液肿瘤科

具有不同ATP结合模式的BTK抑制剂对BCR信号传导的功能影响各不相同