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肖毅教授：单细胞长读测序有助于剖析BTK亚克隆在CLL治疗中的动态变化

06月05日

整理：肿瘤资讯

来源：肿瘤资讯

随着研究的逐渐深入，BTK抑制剂成为慢性淋巴细胞白血病（CLL）治疗的里程碑式药物。BTK是B细胞受体（BCR）信号转导通路中的关键激酶，参与了B细胞的增殖、分化与凋亡过程。BTK抑制剂通过靶向BTK分子发挥抗肿瘤作用，在多项临床研究中展示出了非常好的治疗效果，并且为B细胞恶性肿瘤的无化疗时代创造了可能。然而，连续使用BTK抑制剂可能有助于促进耐药克隆的产生。近期，Gage Black教授等在Blood发文，通过一项纵向研究，探讨了接受BTK抑制剂治疗的CLL患者亚克隆演变情况。本文特别邀请华中科技大学附属同济医院血液科肖毅教授针对该研究进行点评，详情如下。

研究详情

研究背景

BTK抑制剂是治疗 CLL 患者的有效一线疗法。然而，出现 BTK C481S 突变的患者很快就会复发。研究人员最近发表了一项纵向研究，探讨了38例接受BTKi治疗的CLL患者的亚克隆演变情况。在这38例患者中，有6例患者在复发时出现了含有全外显子组测序（WES）数据中发现的BTK C481S突变的亚克隆。

为了明确BTK C481S突变是否能单独诱发复发，或者是否需要额外的CLL相关突变，研究人员使用PacBio多重阵列测序（MAS-seq）对这些亚克隆进行了单细胞水平的研究。MAS-seq 可生成单细胞长读程 RNA 测序数据，准确度高，可覆盖整个 mRNA 转录本。

研究结果

从每例患者的BTKi治疗前样本和复发时样本中分离出B细胞。使用 10X Genomics Chromium 平台生成单细胞 cDNA 文库预处理。然后使用 MAS-Seq 对 cDNA 进行测序。使用 PacBio 的 Isoseq 管道处理 MAS-seq 数据后，应用Seurat对每个样本进行单细胞分析。使用贝叶斯统计方法 scBayes，根据先前确定的体细胞突变的表达，为单个细胞分配亚克隆身份。与传统的单细胞 RNA 测序方法相比，MAS-seq 的转录本全覆盖提高了覆盖体细胞突变位点的可能性。

研究结果

我们对本研究中的 4 例患者（pt 1-4）的样本进行了测序和分析。在患者1的预处理样本中，存在两个含有不同TP53突变的亚克隆。复发时，从其中一个 TP53 亚克隆演化出一个 BTK C481S 亚克隆，成为优势克隆群体。该患者体内未检测到其他与 CLL 相关的突变。患者2-4在复发时，其优势亚克隆中的 BTK C481S 突变也发生了与 CLL 相关的突变。在患者2中，一个带有 NFKBIE 和 BTK 突变的亚克隆是从一个存在 BRAF、BCOR 和 EGFR2 突变的细胞群中演变而来的。患者3 中的 BTK C481S 亚克隆也有新的 KMT2D 和 CREBBP 突变。该亚克隆从带有 ASXL1 和 SF3B1 突变的细胞群演变而来。在患者1-3中，BTK 亚克隆只在复发时才出现。患者4在治疗前未发现任何与 CLL 相关的突变。在复发前 6 个月采集的样本中，可以低频看到 BTK C481S 亚克隆，但没有其他与 CLL 相关的突变。在复发时，从 BTK 亚克隆演化出一个 DICER1 变体，该基因最近与 CLL 有关联（Knisbacher et al., Nature Genetics, 2022），在复发时成为显性亚克隆。此外，单细胞水平的全转录本测序使我们能够确定复发时存在的第二个 BTK C481S 亚克隆，并确定它独立于同时含有 BTK C481S 和 DICER1 突变的亚克隆。第二个 BTK 亚克隆没有其他与 CLL 相关的突变，而且出现频率很低。

研究结论

通过 MAS-seq 进行单细胞长线程 RNA 测序可覆盖整个转录本，从而对体细胞突变位点进行基因分型。利用这种方法，研究人员发现显性复发克隆均含有 BTK C481S 突变，该突变要么与其他 CLL 相关突变共同进化（3/4 患者），要么发生在现有 TP53 突变的背景上（1/4 患者）。

大咖点评

肖毅

医学博士、主任医师、博士生导师、博士后流动站导师

华中科技大学同济医学院附属同济医院血液科副主任
同济天佑医院（武汉科技大学附属天佑医院）血液科名誉主任
德国汉堡大学骨髓移植中心访问学者
中华骨髓库湖北分库专家委员会常务委员
中国老年血液学会常务委员
中国造血干细胞移植及细胞治疗专业委员会常务委员
中国医药教育协会白血病专业委员会常务委员
中国老年学和老年医学学会老年病学分会全国常委
中国医药教育协会青年委员会委员
中国生物医学工程学会干细胞工程技术分会移植与血浆置换学组委员
中国研究型医院学会血液病精准诊疗专委会委员
中国初保会血液淋巴瘤专委会委员
中国老年学和老年医学学会老年病学分会（湖北）专家委员会主任委员
亚太生物医学免疫学会血液病学分会委员
湖北省医学生物免疫学会理事会常务理事
湖北省医学生物免疫学会血液免疫专委会细胞因子调控分会主任委员
湖北省抗癌协会移植及细胞治疗学组副组长
湖北省中西医结合学会血液病专委会常务委员
湖北省临床肿瘤学会（ESCO）血液肿瘤专家委员会常务委员
湖北省医学生物免疫学会（ESMI）细胞治疗专业委员会常务委员
湖北省核辐射紧急医学救治专家组常务理事
湖北省住培师资教学技能大赛工作委员会专家
湖北省科普作家协会医学科普创作专业委员会委员
湖北省医保基金监督专家组常任监督专家
武汉市血液学会青年委员会常务委员
教育部学位与研究生教育评审专家
美国血液学会注册会员，欧洲血液学会注册会员目前主要从事血液系统各类疾病诊治的临床、教学及科研工作，已在专业领域发表临床和基础研究论文260余篇，其中80余发表在国际学术期刊。主持及作为主要参与者获得国家自然科学基金7项，主持省、市级课题12项，获湖北省科技进步奖2项及武汉市科技进步奖1项，两次获得华中科技大学教学质量二等奖，获得华中科技大学三育人奖，Blood中文版青年编委会编委，国家自然科学基金评审专家

肖毅教授：在慢性淋巴细胞白血病（CLL）的治疗领域，BTK抑制剂作为一线治疗手段，已经显著改善了患者的预后。然而，BTK C481S突变的出现导致了治疗抵抗性和复发，这对临床治疗构成了重大挑战。本文描述的这项创新性研究通过单细胞长读长RNA测序（MAS-seq）技术，为我们提供了关于BTK C481S突变在CLL复发中作用的新见解。

该研究首先对38例CLL患者进行了纵向研究，这些患者在接受BTK抑制剂治疗期间，有6名患者发展出了含有BTK C481S突变的亚克隆。为了深入理解这一突变对疾病复发的影响，研究团队采用了PacBio的MAS-seq技术，这是一种先进的单细胞测序技术，能够提供高度准确的RNA测序数据，并覆盖整个mRNA转录物。
研究结果显示，在复发时，主导的克隆群体中均含有BTK C481S突变。这一发现强调了BTK C481S突变在CLL复发中的核心作用。此外，研究还发现，在3/4的患者中，BTK C481S突变与其他CLL相关突变共同演变，而在1/4的患者中，该突变出现在已有的TP53突变背景上。这一发现对于我们理解CLL的异质性和治疗抵抗性的复杂性具有重要意义。

我们看到，MAS-seq技术在本研究中的应用，展示了其在单细胞水平上进行精确基因分型的巨大潜力。与传统的单细胞RNA测序方法相比，MAS-seq能够提供更广泛的转录物覆盖，从而增加了在体细胞突变位点的覆盖可能性。这一点在识别与BTK C481S突变共同出现的其他CLL相关突变时尤为重要。

基于这项研究的结果，未来的研究可以进一步探索BTK C481S突变与其他基因突变之间的相互作用，以及这些相互作用如何影响CLL的治疗策略。此外，MAS-seq技术的应用可以扩展到其他类型的血液肿瘤，以探索其在血液肿瘤异质性和治疗抵抗性研究中的潜力。

总之，这项研究不仅为我们提供了关于BTK C481S突变在CLL复发中作用的新见解，而且还展示了MAS-seq技术在单细胞水平上进行精确基因分型的能力。随着我们对CLL异质性的进一步理解，以及对治疗抵抗性机制的深入研究，我们可以期待开发出更为个性化和有效的治疗策略，以改善患者的预后。

参考文献

Black G, Huang X, Qiao Y, Moos P, Stephens DM, Marth G, Woyach JA. Single-Cell Long-Read Sequencing Enables the Dissection of BTK Subclonal Dynamics in CLL Treatment. Blood. 2023;142(Supplement 1):1893. doi:10.1182/blood-2023-179425.

责任编辑：Amiee
排版编辑：guangli

06月05日

任丹

蒙城县中医院 | 血液内科