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【中国好声音】胡豫/梅恒教授：以自噬为靶点克服B细胞恶性肿瘤对CAR-T免疫疗法的内在耐药性

03月28日

整理：肿瘤资讯

来源：肿瘤资讯

CAR-T细胞疗法已在治疗血液恶性肿瘤方面取得了显著成效，但复发和耐药性问题仍是其广泛应用的主要挑战。全基因组CRISPR筛选技术有助于识别肿瘤逃避免疫杀伤的关键基因和通路。例如，Lawson等人的研究揭示了肿瘤细胞利用特定基因和通路逃避CTL介导的杀伤。此外，血液肿瘤和实体瘤与CAR-T细胞的相互作用存在差异，如实体瘤中CAR-T细胞需要IFNγR信号以增强细胞毒性。这些发现强调了肿瘤细胞逃避CAR-T细胞杀伤的复杂性。
基于此，华中科技大学同济医学院附属协和医院胡豫教授和梅恒教授团队通过CRISPR/Cas9筛选技术，探索了肿瘤细胞对CAR-T细胞杀伤的敏感性，发现自噬可能促进B细胞恶性肿瘤对CAR-T细胞治疗的耐药性。这一发现为基于机制的治疗策略开发提供了新思路，旨在提高CAR-T细胞免疫疗法的临床效果。近期该研究结果已发表于Cancer Communications杂志，【肿瘤资讯】现将研究重点内容整理如下，以飨读者。

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研究方法

本研究通过基于CRISPR/Cas9的人类全基因组基因敲除筛选，确定了使癌细胞逃避CD19 CAR-T细胞介导的杀伤的关键基因。通过体外细胞毒性实验以及对肿瘤组织和骨髓标本的评估，进一步证实了关键基因在癌细胞对CAR-T细胞易感性中的作用。此外，在小鼠和细胞模型中阐明了影响CAR-T细胞介导的癌症清除的具体机制。

研究结果

全基因组CRISPR筛选确定了自噬介导的对CAR-T细胞的耐药性

首先，通过CRISPR筛选在Nalm6细胞中鉴定了影响B细胞恶性肿瘤对CD19 CAR-T细胞敏感性的关键基因，发现自噬通路基因（ATG3、BECN1、RB1CC1）的敲除与CAR-T细胞抵抗力下降相关，而促凋亡和TNF信号分子的敲除则与之相关。临床样本分析显示，非应答组的自噬相关蛋白水平高于应答组，且这些蛋白的高表达与CAR-T细胞治疗反应性差和生存期恶化相关。此外，mTOR蛋白水平与自噬活性和治疗反应性呈负相关。大规模RNA测序分析也证实了自噬和凋亡相关基因表达与CD19 CAR-T细胞治疗后的临床预后相关，表明这些通路可作为CAR-T细胞治疗的预测性生物标志物。

图片2.png 图1. 全基因组CRISPR筛选确定了介导CAR-T细胞抗性的重要基因

靶向自噬可使体外B细胞恶性肿瘤对CAR-T细胞介导的细胞毒性敏感

为验证自噬在癌细胞对CAR-T细胞敏感性中的作用，研究人员使用了三种与自噬相关的化学自噬调节剂：雷帕霉素（自噬诱导剂）、SAR405和autophinib（自噬抑制剂），并观察到这些药物影响了Nalm6和Raji细胞的自噬活性和p62、LC3B-II水平。体外实验显示，自噬抑制剂预处理肿瘤细胞能增强CD19 CAR-T细胞的杀伤效果，而自噬诱导剂则减弱这一效果。在其他淋巴瘤细胞系中也观察到了类似结果。通过CRISPR/Cas9敲除自噬相关基因ATG3、BECN1和RB1CC1，进一步证实了自噬对癌细胞的保护作用，且这些基因的敲除不影响CD19蛋白的表达。此外，羟氯喹和氯喹预处理也能促进CAR-T细胞的杀伤作用。这些发现表明，抑制自噬可通过独立于CD19 CAR靶点的机制提高癌细胞对CAR-T免疫疗法的敏感性。尽管自噬抑制对CAR-T细胞的功能影响不大，但它确实增强了CAR-T细胞的颗粒酶B表达。这些结果提示癌细胞内在的自噬可能有助于其抵抗CAR介导的细胞毒性，但其具体机制还需进一步研究。

图片3.png 图2. 自噬在体外保护B细胞恶性肿瘤免受CAR-T细胞介导的细胞毒性的侵害

靶向自噬可通过促进TNF-α-TNFR1轴介导的细胞凋亡增强CAR-T细胞的抗肿瘤活性

通过RNA测序分析了对照细胞和自噬靶向细胞的转录网络，发现使用autophinib或敲除RB1CC1后基因表达显著变化，凋亡通路在白血病细胞中起重要作用。药理和基因抑制自噬诱导了caspase8和caspase9的裂解，促进了细胞凋亡。自噬抑制后，TNF-α受体TNFRSF1A显著上调，与STAT1的结合和依赖性诱导有关。CAR-T细胞分泌的TNF-α在共培养后增加，且TNF-α阻断抗体或敲除TNFRSF1A能降低癌细胞对CAR-T细胞的敏感性。结果表明，TNF-α-TNFR1信号传导是自噬介导的癌细胞对CAR-T细胞耐受性的关键因素。

自噬抑制剂抑制肿瘤生长并重塑小鼠肿瘤微环境（TME）

为了研究自噬抑制对肿瘤生长和免疫格局的影响，我们在携带A20淋巴瘤的小鼠模型中使用了autophinib和SAR405两种自噬抑制剂。结果显示，这两种药物能有效抑制肿瘤生长并减轻肿瘤重量。免疫分型分析表明，自噬抑制剂治疗增加了CD3 T、CD8 T、Th1和NK细胞在肿瘤中的浸润，同时减少了免疫抑制细胞如MDSCs、调节性T细胞和M2型巨噬细胞的数量。骨髓中的免疫细胞组成未受显著影响。此外，CD3 T细胞对A20肿瘤的浸润增加得到了免疫组化的验证，而F4/80巨噬细胞的浸润没有变化。IHC检测显示，自噬抑制剂治疗的A20肿瘤中裂解的caspase9水平较高，表明细胞凋亡增加。这些结果表明，自噬抑制可能通过调节肿瘤免疫微环境和促进细胞凋亡来增强抗肿瘤效果。

靶向自噬可增强白血病和淋巴瘤小鼠模型中CAR-T细胞介导的杀伤力

通过在M-NSG小鼠中使用luc Nalm6细胞建立模型，并注入自噬靶向或非靶向的CD19 CAR-T细胞，研究人员发现尽管体外细胞毒性受到抑制，SAR405处理的CAR-T治疗小鼠表现出抑制肿瘤生长和改善生存的结果。此外，RB1CC1基因敲除的luc Nalm6细胞在体内对CD19 CAR-T细胞的杀伤更敏感。在淋巴瘤小鼠模型中，CD19 CAR-T细胞与SAR405联合治疗或RB1CC1敲除的Raji细胞，均能有效抑制肿瘤生长并减轻肿瘤重量。流式细胞术和IHC染色结果表明，这些处理增加了CD3 T细胞在肿瘤中的浸润，并提高了细胞凋亡率。此外，SAR405对肿瘤细胞自噬活性的抑制效果更为显著，而不影响CAR-T细胞的自噬活性或PD-1和CD69的表达。综上，这些发现表明自噬信号在CAR-T细胞的抗肿瘤作用中起着关键作用，并且在B细胞恶性肿瘤中破坏自噬信号可能有助于克服CD19 CAR-T细胞的耐药性。

图片4.png 图3.自噬靶向技术提高了CAR-T细胞在白血病和淋巴瘤小鼠模型中的杀伤力

靶向自噬通过STAT1/IRF1轴介导的CXCL10和CXCL11上调增强CAR-T细胞的趋化能力

经autophinib处理或RB1CC1敲除的肿瘤细胞能够增强CAR-T细胞的体外趋化能力，这与小鼠模型中观察到的免疫细胞浸润增加一致。RNA测序和GSEA通路富集分析揭示了自噬靶向与对照Nalm6细胞间差异表达的基因主要涉及细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号转导和细胞膜DNA传感通路。特别是，趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11在自噬抑制后表达水平上升，并通过CXCR3依赖的途径促进CAR-T细胞的招募。进一步研究表明，STAT1-IRF1调控模块在多个炎症相关基因的启动子区域活跃。自噬抑制导致IRF1蛋白水平升高，并且STAT1和IRF1直接结合到CXCL10和CXCL11的启动子区域，促进它们的表达。敲除STAT1或IRF1能够抑制CAR-T细胞的趋化能力，而STAT1 shRNA预转染消除了IRF1的诱导，表明STAT1/IRF1轴的激活是趋化因子表达的关键。此外，我们发现自噬抑制可能通过促进细胞膜DNA的积累来激活STAT1的转录和磷酸化，这一点通过非反应组中pSTAT1蛋白水平的升高得到了证实。因此得出结论，癌细胞自噬活性的减弱通过上调STAT1和IRF1，增加细胞膜DNA的积累，从而促进CXCL10和CXCL11的表达和分泌，增强CAR-T细胞的招募和抗肿瘤活性。

结论

总之，全基因组CRISPR筛选发现了对CAR-T介导的杀伤性抵抗至关重要的自噬相关基因，并表明通过基因或药物抑制自噬可以改变癌症免疫信号转导，提高对CD19 CAR-T细胞的反应性。本研究结果提供了一个新的视角，即通过促进TNF-α-TNFR1介导的细胞凋亡和STAT1/IRF1诱导的趋化因子信号激活，靶向癌症内在自噬可挽救CAR-T细胞疗法的失败。这些发现可能会为 "CAR-T + X "联合疗法提供一个有希望的基础，并有助于提高CAR-T细胞疗法的临床疗效。

参考文献

Lu Tang, Huan Zhang, Fen Zhou, et al;Targeting autophagy overcomes cancer-intrinsic resistance to CAR-T immunotherapy in B-cell malignancies；Cancer Communications. https://doi.org/10.1002/cac2.12525.

责任编辑：Mathilda
排版编辑：Mathilda

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