恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一，具有较高的死亡率，基于未被满足治疗需求，新型抗肿瘤药物的研发一直在如火如荼地进行。抗肿瘤药物从研发到上市需要经过多次筛选、临床前研究以及临床试验等，采用合适的肿瘤模型对于药物筛选非常重要。本期肿瘤资讯特别邀请浙江省肿瘤医院徐一鹏教授从新药研发成本、肿瘤研究模型的分类以及各种模型的优缺点方面进行分享。
浙江省肿瘤医院泌尿外科副主任医师，Charité-Universitätsmedizin Berlin博士。Signa Vitae编委，JOMH编委，Life Research青年编委。Frontiers in Immunology、Aging、《现代泌尿外科杂志》、《肿瘤学杂志》等杂志审稿专家。主持浙江省自然科学基金1项、浙江省卫生厅项目1项。3年内发表SCI论文15篇，影响因子83.788。单篇10分以上2篇（Redox Biology、Nucleic Acids Research）。第一发明人身份获国家级发明专利2项。
浙江省肿瘤医院 · 技能培训中心主任
浙江省肿瘤医院 · 青年科学技术协会会长
浙江省肿瘤医院 · 第八届团委委员
浙江省肿瘤医院 · 泌尿外科青年文明号（省级号）号长
德中分子医学和分子药学学会（DCMP）青年理事
中国抗癌协会 ∙ 整合肿瘤肾脏病学专委会秘书
浙江省数理医学学会 ∙ 泌尿男系统肿瘤专业委员会常委兼秘书
浙江省医学会∙ 泌尿外科分会 ∙ 第九届青年委员会青年委员
浙江省抗癌协会 ∙ 第一届泌尿男生殖系统肿瘤专委会青委会委员
浙江省医师协会 ∙ 青年医师分会委员
浙江省医师协会 ∙ 泌尿男生殖系统肿瘤专委会 ∙ 快速康复学组学组成员
浙江省抗癌协会 ∙ 第一届肿瘤微创诊治专业委员会 ∙ 罕见肿瘤学组学组成员
中科院医学所 ∙ 浙江省核酸适体与临床诊治重点实验室成员
肿瘤新药研发成本高昂
据统计，肿瘤新药从研发到上市的成本大约是27亿美元。因为新药的研发过程非常漫长，包括从化合物库筛选到开展临床前研究，继而选择合适的药物进行临床研究等。通过不断的研究进展，最终才能研发出可用于临床的治疗药物，这一系列步骤导致新药的研发成本高昂。此次分享聚焦于新药研发的Stage2阶段，即在开始临床试验前如何筛选出有效的药物。
肿瘤模型与新药研发成本息息相关
肿瘤模型种类较多，不同模型对于新药研发成本有较大的影响。优秀的肿瘤模型更契合机体内环境，可以降低与药物研发相关的成本，例如可以减少临床前研究所需的试验动物数量，并且在药物疗效以及毒性预测方面也更可靠，能够筛选出更有效的药物，降低药物退出临床研究的风险，防止由于药物研发失败导致的资金损失。
肿瘤研究模型的分类
目前常用的肿瘤研究模型包括2D细胞培养、3D肿瘤模型以及动物肿瘤模型。由于各模型都有其独特的优势，因此可能不存在所谓“最好的模型”，根据研究类型应用合适的模型，才能筛选出所需要的研究成果。
2D细胞系
肿瘤细胞系，即Cell lines，时至今日仍在肿瘤研究中占有重要地位，是因为细胞株在体外非常容易进行培养和开展试验。但细胞株也存在一个很大的缺陷，那就是不具备肿瘤微环境。虽然细胞株都是从病人的肿瘤组织中获取，但是在细胞株创建伊始就要进行纯化，随着不断地体外增殖，尽管该肿瘤细胞株中还含有肿瘤细胞，但在纯化过程中失去了肿瘤所具备的微环境，例如支持性的非肿瘤细胞的基质、血液系统、免疫系统，以及一些其它的肿瘤微环境因子。鉴于此，单纯用细胞株进行PD-1/PD-L1相关的免疫治疗研究已经受到很大的限制。此外，虽然细胞株都是在体外培养，但由于不同细胞的生长速率不同，因此不断的培养和传代过程对于细胞株而言是一个筛选的过程，一些优势细胞会逐步留存。而且随着体外培养环境的改变，细胞会逐步适应体外培养环境，而失去原有特征，这一点在DU145和PC3这两大前列腺癌细胞系中的体现最为明显，虽然两者仍属于前列腺癌细胞，但其不表达前列腺特异性抗原（PSA），以至于部分期刊对使用这两种细胞所做实验的认可度有限，目前细胞株也广受诟病。
2018年发表在Nature杂志的一篇文献说明了肿瘤细胞系的缺陷。该研究对两个实验室培养的 106 个人类细胞系进行了基因组分析。研究结果出乎意料地发现来源于不同实验室的同种细胞株所表现的表型是不同的。其中最典型的是文中提到的MCF7乳腺癌细胞株，研究者仅在不同实验室的MCF7细胞中就发现了27个变异株。同时，研究还发现相同药物对于不同的来源变异株的IC50曲线结果差别很大。这解释了为何细胞株广受诟病，以及目前正在探索用3D或者动物模型去复刻一些实验，而不是像以前单纯在细胞株上进行验证。
此外，目前大部分细胞株仍采用二维的方式去培养，也就是将其在培养皿或细胞培养瓶中进行培养。当垂直于培养皿观察时，2D与3D细胞结果相似，但如果平悬于培养皿或培养板观察时会发现2D细胞会像纸一样平铺在培养板上，在进行药物实验时药物可以与细胞进行充分接触，因此在2D细胞中进行的研究效果往往较好，但在动物实验以及临床试验中则可能效果欠佳，这也是二维培养最大的一个缺陷。
肿瘤类器官（PDO）
随着科技的发展，3D培养逐渐被大家所认识，其中最著名的是PDO，即肿瘤类器官培养，此外还有被大家熟知的Spheroids。这两者的区别在于，类器官来源于肿瘤组织，Spheroids则来源于3D细胞模型或者活检组织。
类器官的构建与细胞培养类似。首先将组织进行粉碎，取得单细胞悬液，然后将肿瘤细胞和间质细胞统一在水凝胶中培养，最终整个类器官培养成功后便可用于基因或药物研究。
类器官之所以广为应用，是因为其准确度较高。研究发现，PDO预测局部晚期直肠癌对放化疗的敏感性，准确率可以达到84%；PDO结合微流控芯片在肺癌中的一些预测结果发现，准确率甚至可达到100%。但是类器官也有一定缺陷，类器官尤其是不同病种的类器官培养成功率差异较大，例如前列腺癌类器官的培养成功率大约为10%-15%，但结直肠癌等一些恶性程度较高的肿瘤类器官培养成功率反而会高很多。
如果研究药物敏感性，目前研究者们还是倾向于基于2D细胞株评估IC50的曲线，因为在2D细胞株中，量效曲线会呈现非常漂亮的“S型”。但如果3D单细胞或不同体积的类器官去进行药物敏感性研究，通过体外培养后再用药，量效曲线的离合度会发生很大改变，并且体积越大效果越差。例如用相同药物、相同浓度去刺激不同初始体积的Spheroids，会发现初始体积较小的三维培养细胞或Spheroids的细胞增殖与二维细胞一致，但如果类器官原始体积较大，药物对于细胞增殖或类器官生长影响非常小。也就是说，使用IC50曲线去评估类器官的敏感度高低其实不太合适。
类器官的优势在于它源自原始肿瘤组织，并且基于其原代培养的特性，其与原始肿瘤组织在病理特征、基因突变等多维度具有一致性，可再现肿瘤异质性，并且可传代、冻存，还可进行基因操作。类器官的缺陷在于3D结构的形成依赖于matrigel等基质凝胶，培育操作相比2D细胞更加复杂，容易受肿瘤中正常组织干扰，并且药物敏感性评估体系尚有待于重新建立。
目前PDO的培养可通过在体外形成细胞悬液之后，再结合3D打印去建造3D肿瘤模型。目前3D打印模式较多，例如大家熟知的喷墨式、挤出式，以及光固化式。3D打印的最大优势在于可以让更多细胞，比如间质细胞、干细胞，以及巨噬细胞等存在于模型中。此外，还可以让细胞比例达到可控，可以在体外实现高度仿生的肿瘤免疫微环境。3D打印的创新点在于，从细胞角度而言，通过建立复杂、仿生的多细胞肿瘤3D模型，解决了难以在体外进行人源肿瘤免疫微环境研究的问题；从基质角度而言，通过调控生物材料属性，建立血管化的不同亚型肿瘤模型，开发体外还原肿瘤异质性、研究血管生成新方法。
鉴于类器官构建成功率较低，有科学家进行了一些其他研究，例如患者来源的肿瘤细胞簇（PTC）。PTC与类器官的培养步骤均是将细胞打碎之后进行体外3D培养，但PTC的培养并不是在水凝胶中，而是在非粘附板上，让细胞自主进行组装。细胞的自组装以及3D模型的构建可以在体外完成。PTC的组织特异性与肿瘤组织较为匹配，且具有高度异质性，还可以模拟肿瘤微环境，再现肿瘤特征，而且还保存干细胞特性。相对于类器官，PTC的优势在于构建周期较短，两周便可以出报告，且花费较低，最主要的是PTC培养成功率比较高，可达90%以上。但是PTC最大的缺陷是无法传代，而且基质细胞不如类器官丰富，内分泌治疗、抗血管生成治疗、免疫抑制剂这些药物无法在PTC中使用。
人源肿瘤异种移植（PDX）
PDX是目前最常用的动物实验。PDX的构建是在过获取患者来源的组织后，在体外进行处理并包埋到小鼠皮下，在体外形成动物肿瘤模型。PDX与类器官之间一个非常大的相似点是根据瘤种的不同构建成功率也不同，PDX建模成功率为24%-88%。PDX的缺陷在于成瘤率不稳定、周期长、花费高以及样本量需求大，其中主要缺陷是实验周期比较长，目前基于PDX的药敏研究最快也要三、四个月左右才能够得出结果；PDX的优势在于有血管等体内环境、可通过口服或注射给药、临床一致性高，可达90%以上。因此PDX在预测患者靶向药物治疗疗效、研究耐药机制以及生物标记物相关研究方面有很大优势，但其临床应用受限，多用于新药研发。
针对PDX实验周期长的缺陷，科学家研发了mini PDX模型。2018年发表在Cancer Communications的文章揭示了mini PDX与PDX的区别。mini PDX并不是将组织块包埋，而是把细胞先消化成单细胞、去除血液细胞和成纤维细胞之后，通过小的胶囊的形式包埋于小鼠皮下。Mini-PDX相比PDX的优势在于可保留肿瘤组织一定特性、周期短，可7天得出药敏数据，药敏结果与PDX一致性达92%；缺点在于该模型的应用仍较少，缺乏大规模的临床数据验证，并且mini PDX并非完全意义上的体内环境。
各种肿瘤研究模型的优劣势汇总分析
对于3D培养来说，细胞株最大的优势在于比较容易获得，而且体外培养相对比较方便、简单，其缺点在于二维细胞无法体现生物体内的三维环境，而且缺乏肿瘤微环境；对于动物来说，PDX在反应生理学特征方面较为匹配，在做抗血管生成，包括一些免疫相关研究时可以使用PDX模型，但PDX花费较高；PDO介于两者之间，其花费也同样介于2D细胞与PDX之间。PDO与PDX在一方面相似，即根据病种的不同，构建成功率也不同。
总结
总体而言，无论是3D肿瘤模型、2D细胞系以及PDX模型都各有用武之地。并不是说随着新模型的产生，旧模型就没有存在价值。每一个模型都有其独特的优势，研究者们应该结合研究目的和研究方向，去选择真正适合的研究模型。
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