近日，同济大学第一妇婴保健院王育院长、陈光全副研究员、上海交通大学仁济医院黄珊博士在环境领域著名学术期刊Science of The Total Environment上发表了题为Polystyrene nanoparticle exposure accelerates ovarian cancer development in mice by altering the tumor microenvironment的论文。该论文以人上皮性卵巢癌（EOC）细胞系HEY为体外细胞模型，以小鼠为哺乳动物模型，研究了聚苯乙烯纳米微塑料（PS-NPS）对EOC的潜在作用及相关分子机制。研究发现，PS-NP暴露加速小鼠EOC肿瘤的生长，而在体外实验中，PS-NPs能够降低EOC细胞的相对生存能力，其作用方式具有剂量依赖性。转录组学分析揭示了PS-NP诱导的血栓调节素（THBD）及其调控因子的表达异常引起EOC肿瘤免疫相关反应和肿瘤微环境变化。该研究为PS-NP影响EOC的相关机制提出了新见解。
第一作者：陈光全、黄珊
通讯作者：王育、陈光全
通讯单位：同济大学附属第一妇婴保健院
图片摘要
引言
微塑料(MPs，0.1μm–5mm)及纳米微塑料(NPs，<0.1 m)是塑料降解以及商业生产中产生的新型污染物，被不断释放并积累于自然和生活环境中。MPs及NPs对环境及人类健康的潜在影响已经被越来越多地研究与报道，但其与肿瘤发生发展的关系，仍处于初步探索阶段。上皮性卵巢癌（EOC）是最严重的妇科恶性肿瘤之一，其死亡率位居所有肿瘤类型中的第五位。尽管已有许多研究尝试揭示MPs/NPs对体外肿瘤细胞系的影响，但我们对EOC中NP发挥效应的毒性和作用机制的了解仍然非常有限。聚苯乙烯是一种常用的塑料材料，本研究以人上皮性卵巢癌（EOC）细胞系HEY为体外细胞模型，以小鼠为哺乳动物模型，探讨聚苯乙烯纳米微塑料（PS-NPS）对EOC的潜在作用及相关分子机制。为深入了解PS-NP影响EOC发生发展的相关机制提供参考。
图文导读
图1 PS-NP暴露（饮用水中10 mg/L）及对照组中的小鼠体重（A）肿瘤重量（B）和肿瘤体积（C）
以HEY细胞构建小鼠EOC皮下种植瘤模型，种植第七天开始PS-NP暴露。暴露持续27天，期间实验组及对照组小鼠体重无明显差异（图1A）。暴露7天后，肿瘤生长呈明显的上升趋势，暴露结束后，与对照组相比，肿瘤重量及肿瘤体积分别显著增加54.5%和61.4%（p<0.05）（图1B和1C）。
图2 PS-NP暴露（饮用水中10 mg/L）及对照组小鼠EOC肿瘤组织切片HE染色（A）及具有核分裂相细胞计数（B）
组织学染色见PS-NP暴露组小鼠肿瘤组织中细胞分裂更为活跃（图2A），统计分析具有核分裂相细胞数目可见PS-NP暴露组为对照组的2.8倍（p<0.05）（图2B）。
图3 暴露于PS-NP（10 mg/L）小鼠EOC肿瘤组织的转录应答。（A）通过GESA分析鉴定出的显著富集的GO项。（B）IPA后选定的差异表达基因富集通路。
通过GESA进行GO分析显示，暴露组中几个生物学进程，如固有免疫反应激活细胞表面受体信号通路、固有免疫反应激活信号转导、刺激性C型凝集素受体信号通路，被显著激活。而横纹肌细胞发育、肌原纤维组装以及肌肉细胞发育等进程被显著抑制（图3A）。采用P<0.01和logFC>|0.5| 作为截断值，获得一个选定的基因集，进行IPA通路连锁分析显示，最显著富集的是“肿瘤微环境通路”，其次是“肌苷-5-磷酸生物合成II”和“基质金属蛋白酶抑制”通路（图3B）。
图4 EOC细胞系HEY暴露于PS-NP 48小时（A）和16天（B）后相对生存能力变化情况。划痕试验中暴露于PS-NP 24小时和48小时后HEY细胞迁移情况（C）。EOC细胞中PS-NPs的定位（D），其中细胞核用DAPI染色（蓝色），细胞膜用CellLINK505染色（绿色），PS-NPs以RFP标记（红色）。
在含有PS-NPs的RPMI无血清培养基中暴露48小时后，EOC HEY细胞相对生存能力的剂量-反应曲线如图4A所示。在最高浓度为40mg/L的PS-NPs下，细胞相对生存能力下降至36.1%。与对照组相比，估算EC50为31.5（28.9-34.8）mg/L（95%置信区间）。EC10为15.9（7.9-23.8）mg/L（图4A）。
在RPMI含血清培养基中暴露PS-NPs 16天后，EOC HEY细胞相对生存能力的剂量-反应曲线如图4B所示。在最高浓度为40mg/L的PS-NPs下，细胞相对生存能力下降至42.5%。估算EC50为30.0（26.3-35.3）mg/L。EC10为6.86（4.169-9.411）mg/L（图4B）。
为了确定PS-NPs对EOC细胞迁移能力的影响，进行了划痕实验。20mg/L PS-NPs处理24小时后，HEY细胞相对迁移距离为17.5±2.3%，较对照组显著降低54.7%（p<0.01）。48小时后，暴露细胞的相对迁移距离为23.7±2.9%，较对照组显著降低44.1%（p<0.01）。其他PS-NP暴露浓度与对照组相比没有显著差异（图4C）。
荧光PS-NPs孵育48小时后，激光扫描共聚焦显微镜下可见，大部分纳米微塑料颗粒聚集并结合在细胞膜上（图4D）。
图5 暴露于PS-NP（浓度为细胞生存能力实验中的EC50）的EOC细胞系HEY的转录应答。（A）显著富集的GO项。（B）通过IPA计算的显著调控基因TOP-15富集通路。
通过GESA进行GO分析显示，暴露组中产热正调控、凋亡信号通路调控、内在凋亡信号通路等生物学进程显著激活。与环苷酸第二信使耦联的G蛋白耦联受体信号通路则显著抑制（图5A）。对275个显著差异基因进行进一步IPA分析可见，最显著富集的途径是“软骨细胞在类风湿关节炎信号通路中的作用”，其次是“骨关节炎途径”和“慢性阻塞性肺病的气道病理学”（图5B）。同时还检测到肿瘤免疫应答相关通路，如“肿瘤微环境途径”、“细胞因子在介导免疫细胞间通讯中的作用”和“IL-7信号传导”（图5B）。
图6 PS-NP暴露对EOC细胞/组织中潜在血栓调节素（THBD）介导的肿瘤微环境变化的影响（A）。通过改变THBD的表达，PS-NPs可以影响NFκB复合物、TNF和IL6的产生，从而改变肿瘤微环境。暴露于PS-NPs后，RT-qPCR验证小鼠EOC肿瘤组织（B）及体外HEY细胞系（C）中THBD基因表达水平。
通过比较EOC在体内肿瘤组织和体外暴露细胞中的RNA-seq数据，可见“肿瘤微环境途径”、“基质金属蛋白酶抑制”和“激活素抑制素信号传导途径”等免疫相关过程中，显著基因的富集具有高度一致性。然而，与通路富集结果不同的是，二者之间仅THBD基因具有一致性的显著差异。通过文献检索和IPA网络分析，挖掘THBD的调控网络。结果表明，THBD参与了肿瘤微环境相关通路。NFκB复合体能够与DNA结合，促进TNF和IL6的表达，而这一调控过程可被THBD所抑制。此外，有报道称THBD可抑制IL6表达，TNF可抑制THBD（图6A）。对暴露于PS-NPs的小鼠EOC肿瘤组织和体外HEY细胞独立样本进行RT-qPCR验证，结果提示THBD基因被显著上调，与RNA-seq数据一致（图6B）。
图7 （A）TCGA-OV数据库中THBD高、低表达患者的生存曲线。（B）THBD基因在EOC患者和正常患者中的表达差异。（C）THBD高表达（组1）与低表达（组2）中，不同类型免疫细胞的浸润水平均具有显著差异。（D）THBD表达与免疫细胞具有显著相关性（p<0.05）。
为了研究THBD基因对EOC患者预后和免疫细胞浸润的影响，我们使用TCGA-OV队列进行了分析，结果显示，THBD高表达组（25%，n=105）与低表达组（75%，n=316）的生存曲线差异接近显著（p=0.055），低表达组预后较差（图7A）。此外，尽管EOC患者与正常人之间THBD的表达没有显著差异，但在EOC患者中有明显低表达趋势（图7B）。
使用CIBERSORT算法评估TCGA-OV队列数据集中患者22种不同类型免疫细胞的浸润水平可见，THBD高表达组的记忆B细胞、活化树突状细胞、中性粒细胞、活化NK细胞、辅助T细胞和调节T细胞浸润明显低于低表达组。而M2巨噬细胞、单核细胞、静息树突状细胞、NK细胞和CD4+T细胞的浸润显著高于低表达组（图7C）。进一步检测TCGA-OV患者肿瘤微环境中THBD表达水平与免疫细胞浸润水平的相关性，结果显示， THBD的表达与巨噬细胞、中性粒细胞、CD4+T细胞和内皮细胞的浸润水平显著相关（图7D）。
小结
本研究证明，体外暴露于100nm PS-NPs剂量相关地降低了EOC细胞的生存能力，而通过饮水暴露于PS-NPs促进了小鼠体内EOC肿瘤的生长。在短期和长期EOC细胞暴露实验中，EC50均在30mg/L左右。与对照组相比，小鼠模型中肿瘤重量和体积显著增加（近两倍）。转录组学分析显示，在PS-NP暴露的EOC细胞和小鼠肿瘤组织中，分别有275个基因和16个基因受到显著调控，基因功能和通路分析表明，体外和体内PS-NP暴露均显著干扰免疫相关反应和肿瘤微环境通路。对信号通路的进一步研究和TCGA-OV数据集的生物信息分析表明，THBD介导的肿瘤微环境通路可能是PS-NP效应的关键靶点。这些结果为PS-NPs在小鼠模型和EOC细胞中对EOC肿瘤发展的影响提供了新见解，并为其在哺乳动物中的风险评估提供了更多证据。本研究中发现的显著干扰基因和分子信号的通路可作为PS-NP对EOC细胞/组织影响的潜在研究候选分子和早期生物标志物。
专家介绍
主任医师、教授、博士研究生导师，同济大学附属第一妇婴保健院院长，兼任国家妇产疾病临床医学研究中心上海分中心负责人、中国医药教育协会妇科肿瘤专业委员会主任委员、中国医师协会整合医学盆底专委会副主任委员、上海医学会妇产科分会副主任委员、上海市医师协会妇产科医师分会副会长、申康研究型病房项目负责人、上海市浦东新区重点学科群负责人，并担任《实用妇产科杂志》、《上海医学》等杂志编委。被推荐人长期从事妇产科临床与基础研究工作，熟练掌握妇产科领域疾病综合诊治，擅长各种妇科良、恶性肿瘤的综合治疗以及各种复杂妇科盆底疾病的微创手术治疗。现承担包括国家自然科学面上项目、上海申康医院发展中心三年行动计划项目、上海市卫计委重大项目、上海市科委生物支撑项目在内的多项课题，累计科研经费达5000余万，围绕卵巢癌的侵袭转移机制、卵巢癌肿瘤标记物及卵巢癌的精准治疗等方面开展了系列工作并取得一定成果。以第一作者或通讯作者在国内外核心期刊杂志发表专业论著70余篇，其中SCI收录40余篇，累计影响因子达200余分，以第一完成人获得2022年度上海医学科技奖一等奖。
专家介绍
副研究员，硕士研究生导师，博士毕业于荷兰阿姆斯特丹自由大学遗传学专业。上海人类学学会医学人类学专业委员会，中国学位与研究生教育学会专家库专家。第一作者/通讯作者发表中科院1区的4篇，累计影响因子50，发表SCI论文15篇，合著英文专著1本。作为项目负责人主持科研项目4项，包括国家自然科学基金项目1项，上海市母胎重点实验室开放课题1项和校局级项目2项。曾在德国分子知名分子生物实验室Centogene担任管理及研发工作，参与构建了全球150万人的遗传基因数据库。长期从事第二代测序及分子诊断，分析了超过5000例的遗传罕见病基因测序数据。首次解析了环境微塑料污染对于胎盘及胎儿的毒性分子机制，成果表与环境健康领域中科院1区Science of The Total Environment（IF=9.8）杂志上。目前担任其他学术兼职有，Frontiers in genetics 客座编辑，担任过多个SCI期刊的审稿人，Environmental international (IF 11.8)，Chemosphere (IF 8.8)，Environmental pollution(IF 8.9)等。
专家介绍
妇产科住院医师，博士毕业于南开大学医学院生物化学与分子生物学专业，硕士毕业于南开大学七年制临床医学专业。第一作者/通讯作者发表SCI论文6篇，累计影响因子43。曾在美国The Scripps Research Institute及 Wake Forest University Baptist Medical Center担任博士后，从事细胞衰老与肿瘤发生相关机制研究。
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0048969723062198
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