由福建省抗癌协会癌痛专业委员会和福建省抗癌协会中西医整合肿瘤专委会青年委员会主办的“十邑论坛”开播啦！论坛于每周三推出，带您用中文听原汁原味的美国临床肿瘤学会（ASCO ）研究。本期十邑论坛带来了杜克大学医学院John Strickler教授在今年ASCO大会上所分享的晚期结直肠癌患者中RAS克隆的患者和使用EGFR抑制剂的患者，进行液体和组织活检的争论，【肿瘤资讯】特邀泉州市第一医院洪燕妮教授进行相关研究解读。
泉州市第一医院 肿瘤内科主治医师
福建省抗癌协会癌痛专委会委员
福建省抗癌协会中西医整合肿瘤专业委员会青年委员
福建省抗癌协会肿瘤营养与支持治疗专业委 员会青年委员
泉州市抗癌协会免疫治疗专业委员会委员
精准医学的发展彻底改变了转移性结直肠癌的临床实践。随着分子分析的广泛使用，使得可针对的靶点和靶向治疗药物得以增加，例如：KRAS、NRAS外显子2～4、高度微卫星不稳定（MSI-H）、HER2融合、BRAF V600E、NTRK融合等，而想要充分发挥精准肿瘤学的治疗价值，则需要在治疗前获得可信任的组织和血液检测结果。只有充分了解各种检测的优点和局限性，才能更准确地预知治疗的前景。当然，由于结直肠癌具有独特的特征，使得精准检测、精准治疗亦随之变得复杂。异质性是转移性结直肠癌的一个典型特征，异质性可以发生于病灶内部、体内不同病灶之间以及随时间的变化而变化。循环肿瘤细胞DNA（ctDNA）可以同时捕获体内所有变化，因此，在捕获分子异质性方面具有一定的优势。ctDNA检测的灵敏度取决于循环肿瘤细胞DNA的脱落，而ctDNA的脱落取决于肿瘤体积、肿瘤位置以及相对于患者接受治疗时的抽血时间。血浆相比组织能够更好的捕获基因异质性，而分子异质性和检测质量是本次学术分享的核心话题，与此同时，我们希望解决三个问题，其一是ctDNA是否可以帮助预测一线治疗中化疗联合抗EGFR治疗的结果？其二是具有组织RAS突变的患者是否会失去RAS突变，并从抗EGFR治疗中获益？其三是ctDNA和组织第二代测序（NGS）哪一个是最佳的检测方法？
ctDNA能够识别基线时血浆中的RAS突变，可以影响一线治疗决策
首先，我们针对第一个问题进行解答。在去年的ASCO大会上，Watanabe教授展示了PARADIGM研究的结果（图1），该项研究结果显示，在左侧RAS野生型的结直肠癌患者和全体RAS野生型结直肠癌患者群体中，一线采取帕尼单抗联合FOLFOX6方案相比贝伐珠单抗联合FOLFOX6方案在获益上更具统计学优势。值得注意的是，在该研究中，具有组织BRAF V600E突变和MSI-H的患者并未被排除。在研究初步分析时，亦没有关于组织MSI-H或BRAF状态的信息。值得庆幸的是，研究者搜集了患者的血液进行了事后的ctDNA分析。
图1: PARADIGM研究设计
在今年的ASCO GI大会上Shitara教授团队展示了对于PARADIGM研究中患者基线血浆ctDNA进行探索性事后分析的结果（图2）。在该事后分析中，研究重点是与抗EGFR耐药性相关的标志物，在排除了具有RAS突变、BRAF突变和其他与EGFR耐药相关改变的患者之后，设定了选定组，在该组中包含了HER2扩增、MET扩增、EGFR（ECD）、PTEN、RET、ALK和NTRK1融合的患者，结果发现接受帕尼单抗联合FOLFOX方案的患者在生存风险比上更具优势。在使用定增面板进行ctDNA分析时发现，尽管组织检测呈阴性，但是，仍有超过7%组织检测为阴性患者的血浆中检测到KRAS或NRAS突变，但是，血浆中9.9%的BRAF V600E以及3%的MSI-H的检出率与组织中预期检出的数据相符合。在PARADIGM研究的ctDNA生物标志物探索性研究的表格中可以看到，在基线ctDNA检测中检测到具有RAS突变、BRAF突变、MSI-H的患者，接受贝伐珠单抗联合FOLFOX6方案与帕尼单抗联合FOLFOX6方案治疗具有相似的疗效，甚至贝伐珠单抗组可能更优。由于入组患者数量较少，使得对于MSI-H的分析并不清晰（图3）。
图2: PARADIGM研究事后ctDNA分析设计
图3: PARADIGM研究事后ctDNA分析结果
与PARADIGM研究类似的是FIRE-4研究（图4），该研究并未排除那些具有组织BRAF V600E突变的患者。入组患者的组织RAS检测是在当地进行，并未进行集中检测。Stintzing教授搜集了这些患者的血液，进行事后的ctDNA分析。FIRE-4研究的ctDNA分析结果也显示了在组织和血液中RAS检测的异质性（图5）。尽管，在组织检测中呈阴性，但是，仍有13%的患者的基线血浆中检测到KRAS或NRAS突变。
图4: FIRE-4研究设计
图5: FIRE-4研究事后分析显示RAS在组织和血浆检测存在异质性
在基线血浆中检测到的这些RAS和BRAF突变似乎不仅具有预后意义，至少是在RAS突变的情况下，更具有预测性。因为在研究结果中发现，对于血浆中检测到RAS突变的患者，早期改用5氟尿嘧啶联合贝伐珠单抗具有临床意义，但是，并无统计学的生存优势，p值为0.1。除此之外，对于血浆中新检测到RAS和BRAF突变的患者，RAS和BRAF突变对于患者的生存并无影响（图6）。
图5: FIRE-4研究事后分析显示不同突变对于患者生存的影响
不论如何，PARADIGM和FIRE-4都是非常出色的研究，具有多种优势，包括：其一，均有庞大的患者群体，并且，这些患者群体也存在于ctDNA检测的亚研究之中；其二，ctDNA检测失败率低，各亚组之间没有显著的不平衡等。值得注意的是，这些都是探索性的事后分析，缺乏检测较小亚组生存差异的能力，使得我们尚不清楚这些ctDNA检测样本的ctDNA脱落量，进而影响了我们检测相关亚克隆的灵敏度。在所提供的信息中，亦未看到组织切片的数据，John Strickler教授对于血液和组织中BRAF V600E之间的相关性感到非常的好奇。因此，PARADIGM研究和FIRE-4研究亦存在诸多未解决的问题。作为一名临床医生，非常想知道预测抗EGFR治疗耐药性的亚克隆RAS或BRAF改变的最佳绝对和相对等位基因的频率是多少。与此同时，也深刻地知道DNA不能解释所有的耐药性，可能还有其他机制，例如：转录组的机制在起作用。当然，PARADIGM研究和FIRE-4研究所显示的血浆和组织检测结果的显著差异，也给我们提出了诸多的问题，例如：空间异质性和时间异质性是否是解释这种差异的关键因素。时间异质性是指原发灶在手术切除后的转移灶中出现了RAS或BRAF改变。此外，在这些研究中，还有一个未被充分证实的因素是检测的灵敏度，这可能与研究显著相关。因为这些研究是依赖于聚合酶链式反应（PCR）的检测或在当地进行的检测，而这些检测有时可能出现灵敏度不佳的情况，特别是在进行组织分析之前花费了很长时间的情况下。除此之外，PCR之后还会漏掉部分肿瘤含量较低的RAS突变。因此，这些研究结果具有临床相关性，并且，证明了ctDNA可以识别基线时血浆中重要的RAS改变，进而影响一线治疗决策。当然，这些研究的结果都具有科学上的合理性，并非所有的血浆和组织检测的结果都不一致，组织分析的灵敏度可以解释这些不一致的结果。亚克隆的RAS和BRAF突变有时体现了异质性，但是，个人认为并不会改变晚期结直肠癌诊疗的临床实践。基于PARADIGM研究和FIRE-4研究的结果，当前还存在着这些关键性的未被解决的问题，其一是如何解决ctDNA脱落对于检出灵敏度的影响；其二是高灵敏度的组织NGS检测会具有相似的血浆组织度一致率吗？其三是RAS、BRAF突变亚克隆与临床相关的阈值是多少？在进行检测时，个人依旧会选择高灵敏度的组织NGS检测，因为它不仅可以提供KRAS、NRAS和BRAF信息，而且，还可以提供所有相关生物标志物的更完整信息。
KRAS第二外显子的RAS突变与NeoRAS野生型现象密切相关
如今，我们已经了解基线时的RAS突变可以预测抗EGFR治疗的耐药性，而NeoRAS，即RAS突变的转移性结直肠癌患者在治疗后转变为了RAS野生型的结直肠癌患者，在以RAS突变驱动开始的标准化的治疗之下，是否会丢失RAS突变并可能对抗EGFR敏感呢？自2017年首次报道了NeoRAS野生型的现象之后，可以在文献中多次看到NeoRAS野生型的系列病例报告。通过对文献的回顾，目前尚不清楚NeoRAS野生型的发生频率以及对比标准治疗，患者是否能够从抗EGFR的治疗中获益，尤其是那些标准疗法正在改善的难治性患者。
截至目前，来自MD安德森的Jason T.Henry教授团队在2020年针对NeoRAS野生型的发生率进行了最为深入的研究。在一个纳入了306例患者的研究中，研究者在排除了那些低ctDNA脱落的患者之后，在1.6%的患者中发现了NeoRAS野生型的现象。随后，研究者们在商业ctDNA数据库中验证了这些发现，再次排除了低ctDNA脱落的患者后，在7％的患者中发现了NeoRAS野生型现象。在这些患者中，大约有20%的患者ctDNA脱落不足，无法检测到RAS突变（图6）。
图6: Jason T.Henry教授团队针对NeoRAS野生型现象的研究
与此同时，Osumi教授团队在相关研究中，选取了478例在组织中检测到RAS突变的患者作为研究对象，并让他们接受多线治疗。随后将未进行ctDNA脱落校正的患者作为A组，并进行了ctDNA检测。研究结果显示，在19%患者的血浆中未检测到RAS突变，即1/5的患者为NeoRAS野生型。在排除了ctDNA阴性的样本之后，NeoRAS野生型患者的比例下降至9.8%。个人猜想在排除了ctDNA脱落低的样本之后，RAS突变的灵敏度应该会下降的更低（图7）。因此，个人认为NeoRAS野生型的现象可以用低ctDNA脱落以及其他技术因素加以解释。当然，在研究结果中，亦可看到在ctDNA脱落率较高的患者中，NeoRAS野生型的现象亦可能发生，这可能是时间异质性所致，例如：当RAS野生型在这些疗法上相比RAS突变型更具有适应性优势时，则可能发生这种情况。
图7: Osumi教授团队针对NeoRAS野生型现象的研究
这个猜测并非没有依据。在多年前就知道后期的RAS突变在原发肿瘤组织中相对罕见，但在抗EGFR单一疗法的压力下会增加。在停止抗EGFR治疗时，可以看到那些RAS变异体，特别是后期的RAS变异体，会随着时间的推移而衰退和消失（图8）。那么，是否后期的RAS变异体相比RAS野生型克隆更不适合呢？如果猜想的确如此，则个人期望在这些扩展的RAS变异体中能够看到更高的NeoRAS野生型的发生率。
图8: RAS变异体随抗EGFR治疗停止的变化规律
至少在Osumi教授团队的研究中，的确如此。在他的分析中，后期的RAS变异体出现NeoRAS野生型的发生率是KRAS第二外显子变异体的两倍，即组织中除KRAS第二外显子的RAS突变与NeoRAS野生型现象密切相关，未来还需要进一步的研究验证这些发现。当前，对于NeoRAS野生型现象还存在着诸多不解之处，未来希望能够更快的看到NeoRAS野生型现象的标准化定义。
NeoRAS野生型现象研究方兴未艾
需要引起大家注意的是在没有确凿的证据之前，在临床实践中进行抗EGFR治疗之前依旧需要进行组织活检，以确认RAS突变是否丢失。基于美国食品药品监督管理局（FDA）的指导，没有突变不代表患者就是野生型，因此，目前正在进行多项国际研究以明确EGFR疗法以及NeoRAS野生型现象的潜在用途。
总之，在这场RAS克隆之间以及液体活检和组织活检之间的较量并没有赢家。不论组织NGS检测还是ctDNA检测都是普通的检测工具，都具有各自的优势和局限性。只是说将ctDNA检测添加至组织检测中可以捕获临床相关的异质性。最终还是需要结合临床情况和患者的可负担性选择相应的检测方法。
大家可以自行下载对应幻灯，再配合本音频听，效果更好。
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