上海交通大学医学院附属瑞金医院 血液科
主要从事急性早幼粒细胞白血病早期致死性出血的临床及基础研究，为APL的治疗攻克最后壁垒。至今已在《Blood》等期刊发表SCI论文共13余篇，10分以上3篇，累计总影响因子96.9，被引258次，其中第一/通讯作者8篇，包括：Clinical Cancer Research (IF 11.5), Frontiers of Medicine (IF 8.1),Translational Neuro Degeneration (IF 12.6)等杂志。
对于急性早幼粒细胞白血病 (APL) 患者，如果不及时预防和干预颅内出血 (ICH)，可能会致命。它是治疗失败和发生早期死亡的主要原因。因此，能够及时预测严重并发症的生物标志物至关重要。在这里，我们研究了伴有和不伴有 ICH 的 APL 患者之间的细胞因子差异，以开发APL背景下ICH的预测模型。初步分析发现，APL 患者和健康对照之间存在一系列细胞因子显着不同。随后将 APL 患者分为高白细胞计数组和低白细胞计数组。提示肿瘤坏死因子 α（TNFα） 和白细胞介素 8 (IL-8) 对于区分 APL 患者是否发生 ICH 至关重要。此外较大患者样本的验证表明，这两种细胞因子与ICH的累积发生率呈正相关。最后，提供的体外和体内实验证据表明，IL-8 影响 APL 衍生的 NB4 细胞的迁移，并损害 PML/RARα 阳性急移植 FVB/NJ 小鼠的血脑屏障。这些评估可能有助于 ICH 的早期预警并降低未来 APL 的死亡率水平。
引言
急性早幼粒细胞白血病（APL）是一种由PML/RARα融合蛋白驱动的血液恶性肿瘤。尽管全反式维A酸（ATRA）和相关治疗方案已显示预后有很大改善，但由于诱导前和诱导过程中发生严重出血，APL仍受到早期死亡问题的困扰。如果不及时发现和干预，出血可能是致命的[1,2]。颅内出血（ICH）通常是灾难性的，在 APL 致命出血事件中所占比例最高[3]，仍然是 APL 治疗的主要挑战。
ICH（尤其是致死性出血）的预测因素包括白细胞增多、外周原始细胞计数增加、血小板计数和纤维蛋白原 (Fg) 水平降低、凝血酶原时间 (PT) 延长以及乳酸脱氢酶和肌酐水平升高。在这些标志物中，白细胞增多被认为是最强有力的预测因素[4,5]。然而，许多没有以上特征的患者仍然会发生脑出血，这表明其他因素可能会影响脑出血的发生，特别是在没有白细胞增多的患者中。
细胞因子形成细胞外蛋白家族，通过激活其同源受体来刺激造血细胞的生物反应，它们在严格控制造血过程中发挥着至关重要的作用[6-8]。细胞因子表达异常是 AML（包括 APL）的一个基本特征。例如，间充质细胞分泌的白介素6（IL-6）有助于APL细胞的分化和凋亡[12]。肿瘤坏死因子α（TNFα）和IL-6通过刺激DNA陷阱的释放来促进APL细胞的细胞死亡途径[9]。此外，野生型早幼粒细胞白血病蛋白（PML）是细胞因子信号转导的重要调节因子[10]，PML/RARα对PML信号转导的破坏导致APL患者细胞因子表达异常。此外，APL 细胞产生的 TNFα 和 IL-1β 可能有助于内皮细胞和单核细胞活化并导致凝血功能障碍 [11]。然而，APL 中全景的细胞因子情况仍未得到充分探索，并且尚未开展可预测 APL 中 ICH 的血浆细胞因子产生物的研究。
结果
1. 对细胞因子作为APL-ICH预测因子的鉴定
对比15例ICH和24例非ICH患者的进行比较，发现白细胞增多、血小板计数和纤维蛋白原 (Fg) 水平降低以及乳酸脱氢酶升高和出血相关，与既往研究相符合。而利用Luminex对41个细胞因子进行检测，APL-ICH 组和 APL-非 ICH 组之间的几个因素的表达存在显着差异。促进血管生成的趋化因子SDF-1α的循环水平与促进凋亡的细胞因子TRAIL的水平一致，并且两者在APL-ICH患者中均较低。 APL-non-ICH 患者中促炎因子（如 IL-2Rα 和 IL-8）以及促进血管生成的细胞因子 HGF 增加（图1）。
图1
2. TNFα 和 IL-8分别是非高白细胞组和高白细胞组中预测ICH的关键因子
39 例 APL 患者进一步分为低 WBC 计数组（n = 22，7 例有 ICH，15 例无 ICH）和高 WBC 计数组（n = 17，8 例有 ICH，9 例无 ICH）。进行基于随机森林排列的变量重要性测量，以确定诊断时预测 ICH 的潜在生物标志物。在低 WBC 计数组中，四个可变重要性测量中的三个表明 TNFα 是区分 ICH 患者最关键的细胞因子。同时，MIP-1β通过三种方法被鉴定为第二重要因素。其次因子为 IL-2Rα、RANTES 和 GROα（表 1）。因此，TNFα被确定为低WBC计数组中最有力的预测细胞因子。对于白细胞计数高的患者，通过方法1、2、3 确认 IL-8 为最重要的因素，其次是单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)，其余最好的因子是基本 FGF和 SDF-1以及 TNFα。
表1 基于四种方法的随机森林分析中位列前五名的细胞因子
3.累积发生率（CI）与血浆细胞因子有关
正如预测细胞因子值的强度所示，TNFα 和 IL-8 的异常血浆浓度也可以预测 ICH 相关的发生率。考虑到ICH主要发生在发病早期，我们对81例APL患者进行了40天的近期随访（28例高危患者和53例低中危患者） ）旨在确定细胞因子与预后之间的相关性。就高WBC计数组而言，IL-8水平升高的患者ICH发生率为50%（95% CI = 16.3%–76.8%），显着高于IL-8水平较低的患者（5.6 %，95% CI = 0.3%–23.1%，P = 0.008；图 2)。在低WBC计数组中，TNFα水平升高的患者的ICH累积发生率显着高于TNFα水平较低的患者（2.5%，95% CI = 34.2%–88.1%，P < 0.001；图2）。 95% CI = 0.2%–11.4%）。总的来说，只有一名（1.89%）脑出血患者的 TNFα 水平较低。此外，其余 43 名患者中有 4 名 TNFα 水平较高（9.3%）。两组 ICH 患者中 TNFα 和 IL-8 的表达也较高。
图2
讨论
位于骨髓肿瘤中的异常细胞因子和异常的微环境有助于白血病细胞的增殖和存活[16-21]。本研究全面调查了 APL 患者血浆环境的组成性异常，并建立了 APL 相关 ICH 的生物标志物。研究表明，与健康对照相比，APL 患者的一系列细胞因子、趋化因子和生长因子有所升高。炎症介质合成可能阻碍 APL 细胞的分化，并导致癌症的发生和进展 [22,23]。例如，IL-13 抑制 APL 中的第 2 组先天淋巴细胞和单核骨髓源性抑制细胞，导致白血病细胞的存活率增加 [24]。异常的免疫炎症状态参与恶性细胞的迁移、侵袭和转移[30]，APL细胞中MCP-1和IL-8的迁移促进功能就是例证[25,26]。此外，与APL-non-ICH组相比，APL-ICH组中许多细胞因子、趋化因子和生长因子，特别是促炎因子IL-2Rα和IL-8以及增殖相关因子HGF升高。相反，APL-ICH组的血管生成和凋亡促进因子异常，提示免疫炎症、血管内皮紊乱和白细胞过度增殖与APL-ICH组高度相关。 TNFα 和 IL-8 被确定为分别与低和高 WBC 计数组中 ICH 相关的关键细胞因子。
TNFα 由 APL 细胞产生，并与促炎过程中的严重毒性相关[27]。 TNFα还可增强抗血管生成和促炎功能的作用，并抑制周细胞的血管生成功能；它形成血脑屏障的重要细胞成分[28]。在由原代人脑来源的周细胞和内皮细胞组成的血脑屏障模型中，TNFα导致内皮屏障完整性丧失[29]。此外，白血病细胞通过 TNF/JNK-AP1 信号过度表达抗凋亡基因以响应 TNFα [30]。此外，TNFα 已被用来通过调节内皮通透性来模拟渗漏的血脑屏障 [31]。本研究中的预测方法最终可能成为临床决策的有力指南。
血浆 IL-8 水平对 APL 患者高 WBC 组的 ICH 有很强的预测能力。 IL-8具有相对理想的敏感性，能够识别白细胞增多状态下患者发生脑出血的风险，比目前临床上常用的增加白细胞计数更准确地预测脑出血。 IL-8 通常由活化的小胶质细胞、星形胶质细胞、内皮细胞和巨噬细胞分泌。早期报道中IL-8的表达与感染性疾病中的脑内皮损伤相关[32]。 CXCL8（IL-8）/CXCR2网络加重中性粒细胞浸润引起的脑实质损伤[33]，提示血浆IL-8通过内皮刺激触发的正反馈促进微环境的恶化。在本研究中，IL-8 的作用通过体外和体内实验得到证实。结果表明，IL-8有效增加APL细胞的迁移和血脑屏障的通透性，与报道的IL-8在其他肿瘤中的功能一致[34,35]。
最近的研究探讨了APL中ICH的危险因素，包括低白蛋白、高肌酐、尿酸、天冬氨酸转移酶和体重指数[36-39]。然而，这些指标总是出现在疾病的末期，牺牲了预测的最佳时机，不能为白血病相关的病理生理过程提供准确的代表性。在 APL-ICH 方面，实用的预期生物标志物也很少，特别是对于白细胞计数低的患者。此外，迄今为止尚未提供APL中ICH的具体治疗靶点。细胞因子生物标志物可能通过促进预测细胞因子模型的实用性作为 APL-ICH 的治疗靶点。此外，之前关于出血预测因子的研究主要基于临床试验队列，其中绝大多数脑出血患者由筛查程序导致白细胞计数较高的个体组成。因此，在合并前因紧急情况死亡的患者被排除在外。此外，由于患者样本不足，对低白细胞患者脑出血的详细分析也被忽略。在本研究中，通过在首次转诊时收集患者（无论是急诊患者还是门诊患者）来努力避免这些缺点。尽管预测价值得到证实，但样本量有限，白细胞计数未达到显着差异水平。
如上所述，颅内出血事件占据了早期死亡的大部分，仍然是亟待解决的问题。这项研究最初强调了细胞因子分析对 APL 患者问题的预测价值。未来，有必要对不同WBC水平组进行更充分和平衡的采样和机制研究，以确定三种细胞因子在ICH过程中的生物学作用，并可能将其归因于靶向治疗以预防APL中的ICH。
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