机体对高原低压缺氧的适应需要一系列由遗传修饰相关以及转录组调节所实现的生理特征。这导致了个体对高海拔地区缺氧环境的终生适应和西藏等种族的遗传性代际进化。研究表明，对环境暴露敏感的RNA修饰在维持器官的生理功能方面同样起着关键的生物学作用。然而，目前对于低压缺氧暴露下小鼠组织RNA修饰谱变化和相关分子机制仍有待进一步了解。基于此，陆军军医大学新桥医院张曦教授团队近期于BMC Biology期刊发表了题为“Hypoxia induces alterations in tRNA modifcations involved in translational control”的论著，首次系统性描述了小鼠脑、肝、心、脾、肺和睾丸不同种类RNA的RNA修饰谱，揭示了不同组织RNA修饰特征的多样性，提示了DNA序列之外的RNA表观转录组组织特异性。
研究背景
高原自然环境恶劣，低压缺氧可导致急性高原病（AMS）、高海拔脑水肿或肺水肿等疾病，特别是对平原急进高原（海拔高度3500 m 以上）人群。然而，高海拔人群，如西藏人，可适应低压缺氧环境并表现出独特的生理特征，这表明机体存在低氧适应性调节机制，但其机制不完全明了。随着全基因组测序和高通量RNA测序的广泛应用，研究表明高海拔适应机制受遗传性转录组调控。已有研究表明，藏族人群高原适应性机制与EGLN1基因的错义突变和EPAS1基因的SNP有关。然而，表观遗传调控是否参与了高原低压缺氧适应机制尚不清楚。近年来，研究表明缺氧相关基因LINE-1启动子甲基化和染色质重塑与高海拔环境下的缺氧适应有关，这为研究高海拔环境适应的表观遗传调控提供了思路。
RNA修饰已被证明在维持器官正常生理功能中具有重要的生物学作用。m6A作为mRNA 内部最丰富的修饰，已被广泛研究。除m6A外，已有170多种转录后RNA修饰被鉴定，而只有少数几种被系统研究。rRNA和tRNA，作为含有修饰最广泛的细胞RNA，被证明其多种生物学功能与RNA修饰密切相关。rRNA修饰可通过多种方式影响核糖体成熟及蛋白质合成。tRNA修饰可维持tRNA的三叶草结构和及其在翻译中的生物学功能。此外，tRNA修饰水平失调会影响tRNA细胞内定位、氨基酸转移效率、密码子解码保真度、tRNA结构稳定性以及多种tRNA来源的 tsRNAs (也称为tDRs或tRNA衍生片段，tRFs)的生成，而tsRNA在细胞响应各种应激的转录和翻译调控中发挥关键作用。Brandon J发现低氧暴露可诱导rRNA上2'-O-Me甲基化水平改变，产生核糖体异质性，从而适应缺氧环境。Zhang等人报道，m6A修饰及其writers、erasers和readers参与了心脏病和癌症患者机体内的缺氧适应。然而，高原低压缺氧环境下，机体组织RNA修饰谱动态及其在低氧适应调节中的作用机制尚不清楚。本研究通过使用低氧舱模拟高原(>5,500 m)低压缺氧环境，发现低氧暴露可以重塑小鼠睾丸和精子total RNA修饰谱。首次系统描述了小鼠不同组织中total RNA、tRNA-enriched fragments和17-50 nt sncRNAs的RNA修饰谱，并阐明低氧环境暴露可引起不同组织特异性RNA修饰谱的改变。我们还发现，低氧应激引发的RNA修饰水平失调可导致tRNA对RNase稳定性失衡，加速tsRNA的生物生成，很可能进一步抑制细胞整体蛋白翻译、减弱细胞增殖以适应缺氧环境。
研究结果
小鼠组织不同种类RNA修饰谱具有组织特异性
通过使用既往已建立的基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/ MS）的RNA修饰检测平台，研究人员系统地量化了不同类别的RNA [total RNA（rRNA占80%以上）、poly （A）富集的RNA（主要是mRNA，以下统称为mRNA）、~80 nt RNA片段(主要是tRNA，以下称为tRNA富集片段）和17~50 nt sncRNA片段（以下统称为17~50 nt sncRNA）]多种RNA修饰水平。该RNA修饰检测平台的数据显示，腺嘌呤（A）、尿嘧啶（U）、胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）的修饰比例在total RNA、mRNA、tRNA-富集片段和17~50 nt sncRNA中之间存在差异（图1A）。与既往的报道一致，tRNA是修饰最广泛的一类RNA，其中修饰的核苷酸占总核苷酸的10.46%（图1A）。在小鼠total RNA中检测到的所有修饰中，ψ（25.84%）和I（21.31%）所占比例最高，而m5Um（0. 17%）、m1I（0.18%）、m227G（0.22%）和Im（0.27%）仅占修饰核苷酸的一小部分（图1B）。mRNA 修饰中，I（42.89%）、Cm（10.32%）和Gm（9.05%）占了50%以上，而m5C、m1A和Ψ在tRNA-富集片段和17~50 nt sncRNA中占检测到的RNA修饰的50%以上（图1B）。
由于mRNA上的总RNA修饰水平相对较低，研究人员接下来重点分析了小鼠组织中total RNA、tRNA-富集片段和17~50 nt sncRNA的RNA修饰情况（图1C-H）。聚类分析显示，总RNA、tRNA-富集片段和17~50 nt sncRNA中不同RNA修饰的相对表达水平在小鼠组织中存在差异（图1C，E，G），心脏中的RNA修饰谱与其他组织差异最明显，而肝脏和脾脏之间相似（图1C，E，G），这表明不同RNA修饰可能在调节组织特异性功能中起关键作用。为了进一步分析RNA修饰水平的组织特异性，研究人员通过主成分分析，对具有不同RNA修饰水平的不同组织进行分类，发现小鼠组织RNA修饰谱具有组织特异性特征，可以根据RNA修饰的特性区分小鼠组织（图1D，F，H）。与Total RNA相比，mRNA、tRNA-富集片段和17~50 nt sncRNA 修饰谱组织特异性较弱，水平的不同组织的适度分类（图1D，F，H），提示不同种类RNA的RNA修饰谱协同构成了组织特异性RNA修饰identity。
图1. 小鼠多种组织中的RNA修饰特征
组织特异性RNA修饰谱与RNA修饰酶表达水平相关
RNA修饰水平受RNA甲基转移酶、去甲基化酶和RNA修饰特异性结合蛋白动态调节。研究人员接下来想确定组织特异性的RNA谱是否与RNA修饰酶相关，因此他们对小鼠组织RNA进行了高通量RNA-Seq，以明确参与RNA修饰调控的基因的表达水平。根据RNA修饰检测平台和Modomics数据库，研究人员选择了59个基因来分析其在不同组织之间的表达模式（图2A）。结果表明，这些RNA修饰酶在不同组织中表达水平存在差异，且与组织特异性RNA修饰特征相关（图2A-G）。如负责tRNA第九位鸟苷 N1甲基化修饰（m1G）的tRNA甲基转移酶Trmt10a，在小鼠睾丸中表达水平最高，在心脏中表达水平最低（图2B）。与Trmt10a表达水平一致，tRNA-富集片段上的m1G在同样在睾丸中表达最高，在心脏中表达最低（图2C），并且在所有组织的tRNA-富集片段中发现Trmt10a和m1G之间存在正线性表达相关性，r=0.5439，P=0.00196（图2D）。此外，NOL1/NOP2/SUN结构域（Nsun）家族的成员Nsun2，负责哺乳动物RNA中胞嘧啶添甲基化修饰（m5C），在小鼠组织中也显示出与Trmt10a相似的表达模式（图2E）。在不同组织中也发现Nsun2与tRNA富集片段的m5C之间存在线性相关（图2F，G）。有趣的是，当比较所有组织中tRNA富集片段上的m1G和m5C的水平时，研究人员发现m1G和m5C具有很强的正线性相关性，r=0.9133，P<0.0001（图2H）。这种线性相关在Total RNA（r=0.9732和P<0.0001）、mRNA（r=0.9484和P<0.0001）和17~50nt sncRNA（r=0.8906和P<0.0001）中被广泛发现（图2I-K），表明哺乳动物RNA中存在不同RNA修饰的表达相关性。
图2. RNA修饰酶在小鼠组织中的表达
在小鼠组织中不同RNA修饰之间具有多种线性依赖的相关性
既往的研究已经确定了RNA修饰之间的相关性，如tRNA C38 m5C修饰依赖于tRNA 34 Q修饰的存在。此外，通过使用高脂肪饮食诱导的代谢紊乱小鼠模型，研究人员发现m5C甲基转移酶Dnmt2的缺失降低了tsRNA上m5C的水平，并相应地下调了tsRNA上m2G的水平，确定了tsRNA m5C的水平与tsRNA上m2G的水平相关。最近，Ontiveros等人发现tRNA m1G甲基转移酶Trmt10a可以与mRNA m6A去甲基化酶FTO相互作用，并影响mRNA子集上m6A的甲基化水平。因此，本研究系统地分析了小鼠组织中total RNA、tRNA-富集片段和17~50 nt sncRNA中不同类型RNA修饰之间的协同表达关系。结果显示，小鼠组织中的许多RNA修饰表现出强烈的线性依赖相关性（图3）。其中，大多数RNA修饰与其他类型的修饰呈正线性相关（图3B，C），如m5C，m1G，m2G，m22G，而一小部分RNA修饰呈负线性相关（图3B，D），如total RNA中的Am和17~50 nt sncRNA m3C。其中，m1G、m2G、m22G与m5C之间的相关性在小鼠组织所有RNA中表现出最强的正相关性（图3B-D）。此外，在total RNA、tRNA-富集片段和17~50nt sncRNA中，m1A也与m5C、m3C和RNA鸟苷甲基化显著正相关（图3B）。有趣的是，与m1A相比，m6A在total RNA和tRNA-富集片段中没有显示出与其他修饰的强相关性。然而，在17~50 nt sncRNA中发现了m6A与m5C、m1G、m2G和m22G的相对强烈的相关性（图3B）。与既往的研究一致，研究人员发现mRNA中的m6A确实与tRNA-富集片段中的m1G水平有很强的相关性，17~50 nt sncRNA中的m2G和m5C水平也显示出很强的正线性相关性，r=0.9856，P<0.0001。在所有组织不同RNA种类中，不同类型的RNA修饰之间的这些相关性没有组织特异性（图3C，D），表明哺乳动物中RNA修饰水平的协同调节可能是普遍存在的，其潜在机制需要进一步研究。
图3. 不同RNA修饰之间的多重线性相关分析
小鼠不同组织total RNA修饰谱对高原低压缺氧环境暴露敏感
为了进一步探索低压缺氧暴露下小鼠组织中RNA修饰特征的改变，研究人员通过使用低压舱模拟了高海拔缺氧环境，该低压舱的舱压相当于5500米的海拔高度（图4A）。在缺氧组中，小鼠外周红细胞（RBC）的数量在第3周和第5周均显著增加，同时血红蛋白浓度（HGB）和平均红细胞血红蛋白（MCH）也有所增加（图4B），这与之前的研究结果一致。研究人员还观察到外周白细胞（WBC）数量的下调，而红细胞体积没有受到低氧暴露的显著影响。此外，来自常氧组（NC）和低氧组（Hypo）的小鼠组织（脑、肝、心、脾、肺和睾丸）的转录组测序显示，脑、脾和肺中的缺氧信号通路被激活，其中小鼠六个组织的氧化磷酸化和糖酵解通路失调（图4C），这表明机体整体缺氧适应被激活以应对高海拔低气压缺氧环境。为了应对缺氧适应的激活，小鼠组织total RNA上的RNA修饰发生了显著改变，并且在不同组织中显示出差异性（图4D-F）。心脏（具有11种类型的RNA修饰改变）和肝脏（具有7种类型的RNA修饰改变） total RNA修饰水平表现出动态的调节。在所有的RNA修饰中，m227G和m7G分别在肝脏和睾丸中特异性上调，而Um在脾脏中特异性下调，m5U、m5C、m2G在心脏中选择性下调（图4D，E），这表明不同组织在缺氧适应过程中可能存在不同的调控机制。此外，少数RNA修饰类型，ac4C、m1A、I和m3C，在多个组织中显示出显著改变（图4F），这表明机体在缺氧适应下不同组织中共通的分子反应。有趣的是，与缺氧环境下RNA修饰水平的显著变化相比，除心脏外，大多数组织在缺氧暴露下转录组水平无显著变化。综上所述，本研究数据表明缺氧应激可以诱导小鼠组织中RNA修饰特征的动态改变，这些改变具有组织特异性，表明在低压缺氧环境下，RNA 修饰很可能在不同组织的低氧适应调节中发挥不同的潜在作用。
图4. 低压缺氧暴露引起小鼠组织total RNA 修饰特征改变
低压缺氧环境重塑小鼠睾丸tRNA修饰模式
小鼠组织中的total RNA由大量rRNA（超过80%）和一些tRNA（约10~15%）、非编码RNA和mRNA（约2~5%）组成。tRNA作为修饰最广泛的RNA，是mRNA解码和细胞翻译控制的关键调节物。由于tRNA修饰在维持tRNA的更高级结构及其生物学功能中起着关键作用，研究人员接下来重点分析了小鼠组织中tRNA-富集片段和17~50 nt sncRNA上RNA修饰水平特征的改变，以探索低压缺氧暴露下RNA修饰依赖的分子适应机制。令人惊讶的是，与研究人员的预期不符，在低压缺氧环境下，大多数检测到的组织中整体tRNA修饰未有明显变化（图5A，B），其中Am和m227G修饰水平变化较为显著（图5B）。然而，在睾丸tRNA-富集片段中，研究人员发现9种不同RNA修饰水平受到缺氧环境的显著影响（图5B，C）。此外，与tRNA-富集片段类似，17~50 nt sncRNA在组织中的RNA修饰谱基本不受缺氧暴露的影响（图5D，E）。在缺氧暴露下，大脑和睾丸中17~50 nt sncRNA中分别只有4种和3种RNA修饰水平发生显著变化（图5E，F）。
图5. 低压缺氧暴露引起小鼠组织tRNA-富集片段和17~50 nt sncRNA 修饰特征改变
低压缺氧环境引起tRNA修饰模式的重编程影响tRNA对RNase的稳定性
为了研究低压缺氧环境诱导的RNA修饰改变对tRNA稳定性的影响，研究人员从低压缺氧暴露或常氧环境下的小鼠睾丸中分离总tRNA，并分析tRNA对RNase A/T1（RNase A和RNase T1的混合物，其中RNase A特异性切割C和U残基处的RNA，RNase T1特异性水解G残基处的RNA）和胎牛血清（FBS，其包含各种RNase的混合物）的敏感性。结果显示，Hypo组睾丸tRNA-富集片段在RNase A/T1和FBS处理后迅速降解，显示出比NC组更高的RNase敏感性（图5G）。然而，NC组和Hypo组的肝脏tRNA-富集片段的RNase敏感性相似（图5H），这可能与在低压缺氧暴露下小鼠肝脏总tRNA中轻微改变的RNA修饰水平有关（图5A，B）。
为了进一步研究低压缺氧暴露对单根tRNA修饰的影响，研究人员随机选择了几个密码子使用率高的内源性tRNA进行分析。由于total RNA中分离单根tRNA需要大量的total RNA，因此在本研究中，研究人员仅选择肝脏用于本实验；从Hypo组和NC组的小鼠肝脏total RNA中成功分离出5条单根tRNA（tRNAAla, tRNAVal, tRNAGlu, tRNAGly, and tRNALeu）。值得注意的是，低氧组肝脏内源性tRNA修饰谱发生不同程度改变（图6A，B）。在低氧条件下，超过一半的RNA修饰在tRNAAla, tRNAVal, tRNAGlu和tRNALeu中明显失调，而只有3种RNA修饰在tRNAGly上发生显著改变（图6B）。与缺氧暴露下RNA修饰水平的改变一致，在Hypo组中tRNAAla和tRNAVal对RNase A/T1和FBS降解表现出更高的敏感性，而在NC组和Hypo组中tRNAGly对RNase处理表现出相似的敏感性（图6C）。因此，在Hypo组的小鼠肝脏中，tRNAAla和tRNAVal的表达水平显著降低，而tRNAGly的水平在常氧组和缺氧组之间没有显著变化（图6D），这与缺氧暴露下的tRNA修饰改变模式和RNase敏感性一致(图6A，B和E)。
有趣的是，研究人员发现某些类型的RNA修饰在同一组织的不同tRNA中表现出相同的变化趋势（图6A，E）。例如，在Hypo组，Am、Cm和m227G在肝脏tRNAAla、tRNAVal、tRNAGlu和tRNALeu中显著上调，而m2G下调（图6E），这可能与缺氧适应中RNA修饰的组织特异性调节有关。总之，本研究数据表明，在低压缺氧环境中，小鼠组织tRNA在tRNA修饰水平和tRNA表达两个方面影响了tRNA表观转录组。这些结果进一步表明tRNA修饰很可能在高海拔缺氧适应中具有正向调控作用。
图6. 低压缺氧暴露改变肝脏内源性tRNA的RNA修饰特征
低压缺氧诱导的tRNA转录组改变减弱了细胞翻译和细胞增殖
由于tRNA是特定氨基酸转运分子，并在翻译中起着核心作用，低压缺氧暴露下tRNA表观转录组的失调可能会影响细胞对缺氧适应的翻译速率。为了证实这一点，研究人员在常氧条件下和缺氧暴露下从小鼠睾丸中分离总tRNA，并将这些tRNA-富集片段转染入GC-2spd细胞，一种小鼠精母细胞系（图7A）。常氧tRNA转染组和缺氧tRNA转染组之间没有观察到显著的转录水平改变，这与缺氧暴露下小鼠睾丸中的转录组变化一致。正如所预期的，转染来自Hypo组睾丸的tRNA-富集片段确实导致了GC-2spd细胞的整体新生蛋白质合成显著降低（图7B），表明缺氧暴露引起的tRNA表观转录组的失调可能在细胞蛋白翻译中发挥了作用。此外，GC-2spd细胞的细胞增殖速率也受到转染睾丸的tRNA富集片段的影响，其中在NC组中观察到细胞增殖速率受到显著抑制，并且在缺氧tRNA转染组中观察到更明显的细胞增殖抑制（图7C）。
tsRNA在各种基础生物学过程中具有多种多样的调节作用。一些证据表明，tsRNA在细胞翻译过程中，通过与成熟tRNA前体竞争核糖体装载，或通过与mRNA竞争翻译起始因子结合来控制细胞中的整体蛋白翻译速率。据报道，5′tsRNAAla 可以取代m7G-capping mRNA上的翻译起始因子eIF4E/G/A或PABPC1，导致细胞中整体翻译的减少。在tRNA富集片段转染的细胞中，研究人员观察到5′tsRNAAla的增加（图7D），翻译起始因子eIF4A/E的下调（图7E），这可能与增加的tsRNAAla有关。 尽管没有直接证据表明在高压缺氧暴露下tRNA 转录组的改变如何影响小鼠组织中的细胞翻译速率，但本研究数据提供了新的见解，为研究RNA修饰和tRNA表观转录组重编程如何应对高原缺氧适应提供了新方向。
图7. GC-2spd细胞中NC组和缺氧组睾丸总tRNA的功能分析
结论
本研究揭示了小鼠组织特异性RNA修饰特征，并对高原低压缺氧暴露环境下RNA修饰谱的变化进行了全面分析，突出了RNA表观修饰参与机体组织高海拔适应性分子调控的复杂性。
Huanping Guo, Lin Xia, Wei Wang, et al; Hypoxia induces alterations in tRNA modifications involved in translational control; BMC Biol. 2023; 21: 39. doi: 10.1186/s12915-023-01537-x.
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