结外NK/T细胞淋巴瘤（ENKTL）是一种侵袭性极高，具有高度异质性的非霍奇金淋巴瘤，常见于亚洲和南美洲人群。新诊断ENKTL患者的生存率存在显著差异，据报道，其5年总生存率（OS）从40%到90%不等。既往的研究已经证明循环肿瘤DNA（ctDNA）分析在ENKTL中是可行的，并且ctDNA动态监测可用于监测疾病状态。然而，ctDNA在ENKTL中的预后价值还没有被充分研究。近期，陆军军医大学新桥医院的张曦教授、饶军副教授、高力副教授作为共同通讯作者于HemaSphere杂志发表相关论文，分析了ctDNA的特定预后意义，开发了一种新的预后指数模型，将ctDNA整合到PINK-E中（PINK-EC），以预估ENKTL的临床预后。这个新颖的模型将为个性化治疗提供了重要的细节指导。
研究结果
对于低危早期疾病患者，单独放疗可以获得良好的OS，但联合化疗可能不会提供额外的获益。对于高危早期患者，放化疗联合治疗是必要的，对于晚期患者，需要探索更有效的治疗策略。风险适应性治疗在提高新诊断患者的生存率方面起着关键作用。因此，ENKTL的最佳风险分类模型的实施将为指导临床治疗提供更好的帮助。
目前临床实践中使用了几种新诊断的ENKTL风险评分系统，包括国际预后指数（IPI）评分系统、韩国预后指数（KPI）、自然杀伤细胞淋巴瘤预后指数（PINK）和PINK-E联合EB病毒-DNA的PINK-E预后指数。
尽管IPI已在多种淋巴瘤亚型中得到验证，但在ENKTL中仍有争议。根据IPI评分，超过80%的ENKTL患者被归类为低风险，这在部分研究中心没有显示出独立的预后意义。Lee等人提出根据KPI和局部肿瘤侵袭性对患者进行分类，这比IPI评分系统具有更好的预测潜力，但对鼻外疾病患者没有预测性。此外，以非蒽环类为基础的化疗是ENKTL的标准化疗策略，IPI和KPI都是在最初接受CHOP或CHOP样方案治疗的患者中开发的，但这些方案已不再适用。因此，Kim等人提出了一个新的预后模型PINK，包括了四个风险因素（年龄、分期、非鼻型和远处淋巴结受累），与IPI和KPI相比，PINK显示出更好的预测能力。此外，在相同的分析中，外周血中升高的EBV-DNA与低存活率显著相关。将EBV-DNA整合到PINK （PINK-E）中似乎能更准确地预测结果。因此，NCCN指南还建议将EBV-DNA载量的测量和预后指数（PINK或PINK-E）的计算作为初始检查的一部分。然而，PINK和PINK-E模型在一些队列中并不那么有效，并且已经发现它们不能按比例区分患者，还有部分研究表明它们不能很好地区分ENKTL中不同风险组的预后。因此，尚需探索新的预后模型。
ctDNA包括来源于癌细胞的循环无细胞DNA（cfDNA）部分。血浆中的ctDNA越来越多地被用作生物标志物来指导临床决策，从而导致更好的诊断、最佳治疗的评估和纵向疾病监测，以及其他临床用途。治疗前的ctDNA水平和分子反应是侵袭性淋巴瘤预后的独立因素，表明ctDNA可以改善治疗前的风险分层。Alig等人证明，治疗前的ctDNA水平可以预测独立于IPI评分的较短的诊断-治疗间隔（DTI）。Fu等人使用ctDNA和IPI建立了预测OS或无进展生存期（PFS）的模型，该模型具有更好的预后预测准确性。本文研究者既往的工作证明了血浆ctDNA是可行的，还揭示了ENKTL患者的突变谱，并发现ctDNA的浓度与肿瘤分期和肿瘤负荷正相关，但ctDNA的预后意义尚未被完全阐明。
研究方法
在这项研究中，纳入了70例新诊断的ENKTL患者。所有患者在诊断后均接受了实验室、影像学和骨髓检查的基线分期。在进行化疗之前，通过临床评估结合CT或氟脱氧葡萄糖-PET （FDG-PET）对患者进行常规检查。
在初步评估后，根据最新的NCCN指南以及患者耐受性和合并症，所有患者接受6~8个周期的一线化疗方案，包括或不包括放疗。在患者的治疗过程中进行了系列ctDNA分析。还评估了ECOG评分情况。
根据患者的临床特征，计算出IPI（年龄、ECOG评分、分期、LDH水平、结外部位）、KPI（分期、LDH水平、B症状、区域淋巴结）和PINK-E（年龄、分期、非鼻型、远处淋巴结受累和EBV-DNA状态）进行生存分析。当将ctDNA浓度整合到PINK-E评分系统中时，研究人员构建了一个新的预后指数模型（PINK-EC）。通过结合这些参数的指数，将患者分层为3个风险组（低，0~1；中间，2~3；高，4~6）。
研究结果
患者特征
患者的中位年龄为47岁（范围:10~71岁）。男女比例为2.18:1。近一半的患者患有晚期疾病（Ann Arbor Ⅲ/Ⅳ期，n=33，47.1%），29例患者（41.4%）具有B症状。40例患者（57.1%）有淋巴结受累，17例患者（24.3%）表现为非鼻型。值得注意的是，57例患者（81.4%）被诊断为EBV阳性。
根据IPI评分系统，70例患者中有39例（55.7%)被归类为低风险，11例（15.7%）为中低风险，16例（22.9%）为中高风险，4例（5.7%）为高风险。PINK-E分类将患者区分为低、中、高风险组，比例分别为44.3%、20%和35.7%。
治疗和结果
初步评估后，治疗策略包括单纯化疗（39例，55.7%）和化疗联合放疗（31例，44.3%）。初始治疗方案如下：52例患者（74.3%）接受了基于pegaspargase的化疗方案，7例患者（10%）接受了基于L-paraginase的化疗方案，6例患者（8.57%）接受了CHOP样化疗方案，4例患者（5.71%）接受了DeVIC（地塞米松、依托泊苷、异环磷酰胺和卡铂）化疗方案，1名例患者（1.42%）接受了IMEP（异环磷酰胺、甲氨蝶呤、依托泊苷和泼尼松龙）化疗方案。
在治疗后的首次随访评估中，中位随访时间为739天（582~1070天），23例患者（32.9%）死于肿瘤进展或复发或治疗相关毒性。在首次一线治疗后，32例（45.7%）患者达到完全缓解（CR），11例（15.7%）患者达到部分缓解（PR）。
有20例患者（28.6%）在2年内出现疾病进展（POD24），POD24患者的OS比非POD24患者差（P<0.0001）。70例患者的3年OS率和3年PFS率分别为62.6%和48.7%。
三种经典模型中患者PFS和OS的比较
所有患者的风险分类是根据IPI、KPI和PINK-E评分系统计算的。关于IPI评分系统，Kaplan-Meier分析显示中等风险组的PFS和OS比低风险组差（PFS：HR 2.820，95% CI 1.330~5.979，P=0.0035OS；OS：HR 3.371，95% CI 1.353~8.401，P=0.0038），但中等风险组和高风险组之间无差异（PFS：HR 1.369，95% CI 0.346~5.412，P=0.61OS；OS： HR 1.106，95% CI 0.236~5.187，P=0.89）。
KPI评分系统可以很好的区分中等风险组和高风险组（PFS：HR 2.714，95% CI 1.261~5.842，P=0.0054 ；OS：HR 3.232，95% CI 1.306~8.001，P=0.0054）；但不能区分低风险组和中等风险组（PFS：HR 1.258，95% CI 0.963~3.682，P=0.69OS；OS：HR 1.825，95% CI 0.674~6.942，P=0.44）。
PINK-E模型将31例患者（44.3%）分配到低风险组，低风险组和中等风险组患者的生存率有显著差异（PFS：HR 4.283，95% CI 1.350~13.589，P=0.0025OS；OS：HR 5.585，95% CI 1.268~24.599，P=0.0059），但该模型未能区分高风险患者和中等风险患者（PFS：HR 1.322，95% CI 0.612~2.857，P=0.49OS；OS：HR 1.789，95% CI 0.739~4.332，P=0.22）。
新型预后模型开发和内部验证
在本研究纳入的70例患者中，53例（75.7%）患者的血浆中检测到突变。通过ROC曲线的AUC估计ctDNA的最佳截断值，阈值为4.83 hGE/mL（图1A）。低ctDNA浓度和高ctDNA浓度患者的3年OS率分别为86.7%和49.4%，而两组患者的3年PFS率分别为69.0%和37.3%。Kaplan-Meier分析显示，具有高ctDNA浓度的患者比具有低ctDNA浓度的患者具有显著更差的生存率（PFS：HR 2.290，95% CI 1.033~5.079，P=0.036OS；OS：HR 4.633，95% CI 1.376~15.600，P=0.0065）（图1B和C）。 
图1. ctDNA的预测能力。（A） ENKTL中ctDNA的截断值；（B）根据ctDNA进行风险分层和OS评估；（C）根据ctDNA进行风险分层和PFS评估
由于ctDNA浓度是ENKTL患者OS的预后预测因素，研究人员将ctDNA整合到PINK-E 中以建立一个新的预后模型（PINK-EC）。为了阐明PINK-EC评分的预测能力，研究人员检验了区分度和校准度。PINK-EC预测PFS和OS的 Harrell’s C-index分别为0.691（95% CI 0.597~0.786）和0.779（95% CI 0.696~0.863），优于IPI、KPI和PINK-E。同样，在1年和3年的OS方面，PINK-EC的AUC高于IPI、KPI和PINK-E。对于1000个引导样本，1年和3年OS的校准图显示预测值和实际观察值之间具有良好的一致性（图2）。
图2. 比较1年OS（A）和3年OS（B）的预测和实际生存概率的校准图
PINK-EC的预测性能和预测准确性
为了评估PINK-EC在ENKTL患者中的预后预测能力，进行了Kaplan-Meier分析以检查生存结果。低、中、高风险组患者的3年PFS率分别为84.4%、48.5%和15.7%，三组患者的3年OS率分别为92.3%、70.4%和21.8%。此外，两两比较分析显示PINK-EC可以区分中等风险组和低风险组（PFS：HR 3.993，95% CI 1.498~10.649，P=0.019OS；OS：HR 6.642，95% CI 1.788~24.673，P=0.039）和高风险组（PFS：HR 2.290，95% CI 1.088~4.818，P=0.019OS；OS：HR 3.243，95% CI 1.351~7.786，P=0.0044）（图3）。 
图3. Kaplan-Meier曲线显示了基于PINK-EC评分的三个风险组PFS（A）和OS（B）的差异
为了进一步评估PINK-EC与当前预后评分系统在ENKTL患者中的风险分层能力，研究人员绘制了时间依赖性ROC曲线，并计算了相应的AUC，以比较PINK-EC与IPI、KPI和PINK-E的预测准确性。PINK-EC的PFS和OS的AUC比其他三个预后模型更大且更稳定（图4）。
图4. IPI、KPI PINK-E和PINK-EC模型的时间相关AUC比较：（A）PFS和（B）OS
研究讨论
ENKTL是非霍奇金淋巴瘤的一种罕见亚型，预后不良，在大型队列研究中，5年OS率为30%~86%，但大多数研究表明该比率低于50%。迄今为止，对于ENKTL既没有一个最佳的治疗策略，也没有一个确定的有价值的预后指数。几种预测模型已用于ENKTL，包括IPI、KPI、PINK和PINK-E。然而，这些预测模型仍具有争议。尽管IPI系统地预测了侵袭性NHL的预后，但它未能在一些早期ENKTL研究中正确预测生存结果。此外，KPI对鼻腔型ENKTL的生存没有明显的预测作用。PINK适用于非蒽环类药物治疗策略，然而，不能对患者进行单独评估。一些研究甚至表明，PINK甚至不如IPI或KPI。在本研究队列中，IPI可以区分中低风险组，但无法区分高风险组和中风险组。与IPI模型相反，KPI可以区分中等和高风险群体，但不能区分中等风险组和低风险组。PINK-E模型比IPI和KPI模型更能将患者分配到低风险组。它能很好地区分低风险和中风险人群，但不能区分高风险和中风险人群。因此，需要探索新的预后模型。
ctDNA从凋亡或坏死的肿瘤细胞中释放出来，是cfDNA的一部分（3%~93%）。ctDNA的重要优点是它提供了关于肿瘤生物学的动态详细信息，而不需要频繁的活检。使用ctDNA作为治疗反应和存活率的替代物的可能性是一个有吸引力的概念；这种替代物可以缩短研究时间，加快新疗法的发展。一些研究报道，监测ctDNA可以反映治疗反应，监测疾病进展，并有助于预测一些实体瘤的预后。最近，一些研究报道ctDNA在淋巴瘤患者中具有预后价值。本研究人员既往的工作表明ctDNA评估可以预测治疗反应，并以一种非侵入性的方式监测疾病状态。血浆ctDNA浓度与MTV显著相关。在目前的研究中，本研究结果进一步表明，高ctDNA浓度显著预测更短的PFS和OS。
由于IPI、KPI和PINK-E不能很好地对这些患者进行分层，研究者将ctDNA和PINK-E结合起来构建了一个新的ENKTL预后模型——PINK-EC。与传统的评分系统相比，PINK-EC在预后评估和临床应用方面表现出明显的优势：
第一，目前可用的ENKTL预后指数，例如IPI、KPI和PINK-E，没有将分子突变作为预后指标之一。据研究者所知，PINK-EC是第一个结合了ctDNA浓度的ENKTL预后模型。
第二，PINK-EC评分整合了分子病理学结果，提供了卓越的预测准确性和稳定性。
第三，PINK-EC将这些患者更均匀地分为三个不同的风险组，并将他们相互区分开来。
第四，PINK-EC可以有效地识别高风险人群，这可以帮助临床医生及时制定有效和适当的治疗方案。
然而，PINK-EC也有一些局限性。首先，ctDNA阈值的价值以及PINK-EC是否稳定并适用于其他中心仍有待验证。其次，由于ENKTL是一种预后不良的罕见NHL亚型，这项研究招募了来自单个中心的患者，区域差异是否会影响ctDNA的浓度还不得而知。因此，PINK-EC的预后效率需要在未来的大规模多中心临床研究中进一步验证。此外，研究者关心的其他问题包括测序深度、种系突变的排除策略和克隆性造血。
除了这些传统的评分模型之外，一些其他生物标志物也被用于ENKTL，例如，25-羟基维生素D、预后营养指数、C-反应蛋白与白蛋白比率（CAR）和最大标准化摄取值（SUVmax）。与其他循环生物标志物和SUVmax分析相比，ctDNA分析具有更高的灵敏度和特异性。此外，ctDNA提供了一个动态的实时图谱，并在连续监测中独立地及时识别这些新的突变，使其成为监测ENKTL中微小残留病（MRD）的理想工具，并可以纠正肿瘤异质性和活检部位偏差。最近，基于7个单核苷酸多态性（SNPs）的状态为ENKTL构建了一个新的基于7-SNP的模型，这开启了利用分子突变构建ENKTL预后模型的先河。然而，由于本研究中入选的患者数量有限，可能存在潜在的选择偏倚来源。因此，需要进行一项多中心的前瞻性研究来验证PINK-EC对ENKTL罕见发病率的预后意义。
研究总结
在这项研究中，可以发现ctDNA浓度与ENKTL患者的预后显著相关，这可以用来改善常用模型的性能。将ctDNA整合到PINK-E中具有最佳的Harrell's C-index和AUC，并显示出更好的预测能力。综上所述，本研究结果表明，新的预后模型具有良好的预后价值，并可能用于指导患者的个性化治疗策略。
总之，本研究首次前瞻性地评估了PINK-EC模型对ENKTL患者的预后价值。可以发现，组合模型在识别患者的风险分类方面具有优越性。然而，由于本研究入组的患者数量有限，可能存在潜在的选择偏倚。因此，需要一项多中心的前瞻性研究来验证PINK-EC对ENKTL发病率的预后意义。
Dezhi Huang, Qiong Li, Xinlei Li, et al; The Novel Prognostic Index Model of Combining Circulating Tumor DNA and PINK-E Predicts the Clinical Outcomes for Newly Diagnosed Extranodal NK/T-cell Lymphoma; Biomarker research;http://dx.doi.org/10.1097/HS9.0000000000000822.
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