肺癌是全球癌症死亡的主要原因，大约85%的病例是非小细胞肺癌(NSCLC)，肺腺癌和肺鳞状细胞癌是最常见的亚型。大多数患者目前处于III-IV期疾病，治疗选择和生存率有限。早期(I-II)疾病患者通常接受以治愈为目的的治疗，手术切除或根治性放疗，而局部晚期疾病(IIIA/B)患者则接受手术和辅助化疗或放化疗(CRT) /免疫检查点抑制剂(ICIs)治疗。在这些患者中，治疗后的常规监测使用系列放射成像来检测疾病复发，但灵敏度有限。
目前需要具有高特异性和敏感性的微小残留疾病(MRD)检测生物标志物，以更好地识别有复发风险的患者，以及那些可以从额外的辅助和主要的维持治疗中获益最多的患者，同时避免对已经成功治愈的患者进行过度治疗。
大量研究已表明，血液中的循环肿瘤DNA (ctDNA)可以用作液体活检，为评估癌症患者的肿瘤负担提供了一种微创诊断工具[1,2]。DNA片段通过细胞凋亡、坏死或主动释放，以游离DNA的形式释放到血液中。在癌症患者中，DNA也从肿瘤细胞中释放出来，而这种ctDNA可能只代表了总细胞游离DNA的一小部分。最初的研究使用数字PCR和BEAMing等方法分析了特定癌症类型常见的个体体细胞突变[3,4]，后续研究利用下一代测序(NGS)并行监测多个突变[2,5,6]。ctDNA检测的灵敏度可以通过错误抑制技术或分析大量的体细胞变异或更大的血量来提高[7-9]。基于肿瘤的先验分析开发的ctDNA检测方法，在满足高特异性的同时，灵敏度能达到十万分之几或更低[10-12]。
这些NGS技术方法上的改进，使ctDNA作为临床应用的液体活检快速发展，目前正在研究或应用于癌症诊断，指导治疗选择，监测治疗反应和识别新出现的耐药突变[1]。随着高灵敏度患者特异性检测方法的发展，ctDNA已被用于检测乳腺癌、结直肠癌、肺癌和其他实体肿瘤患者的MRD[13-18]。
本研究中，共有100例未接受治疗的IA-IIIB期NSCLC患者被招募到肺癌循环肿瘤DNA (LUCID)研究中，这些患者计划接受以治愈为目的的治疗。血液采样计划：治疗开始前，治疗期间(根据治疗计划)，治疗结束后以及最多三次定期临床随访时(每3个月一次)。最终，筛选合格88人，共采集363份血浆样本。随访时间中位数为3年(范围: 42天~5年)。
图1 患者特征、样本可用性和ctDNA分析结果配对流程图
本研究采用肿瘤WES测序来在追踪患者血液中特异已知的48个体细胞突变检测方法（Tumor-informed），其中RaDaRTM检测术前/后连续血液样本，至少4毫升的血浆。
研究者分析了88例早期NSCLC (I/II/III期48.9%/28.4%/ 22.7%)患者的363份连续血浆样本，主要是腺癌(62.5%)，以治愈目的治疗包括手术(n=61)、手术联合辅助化疗/放疗(n=8)或放化疗(n=19)。
图2 研究设计-100例NSCLC I-III期患者被纳入LUCID研究
结果显示，WES检测发现的SNV中位数328个/患者，其中99.8%是特定患者的个性化突变。RaDaRTM检测成功设计并验证了90例患者中的88例(97.8%)，以及LUCID研究中100例患者中的88%，包括69/70(98.6%)接受手术的患者和19/30(63.3%)未接受手术的患者。
在基线节点，治疗前预处理样本检测出ctDNA，即ctDNA阳性检测率为51%(40/78)：
I期患者检测出ctDNA的比例为24% (10/41)，II期患者为77% (17/22)，III期患者为87%(13/15)；肺鳞癌患者治疗前检测ctDNA的比例(80%，20/25)高于腺癌患者(29.8%，14/47)；治疗前检测到ctDNA的共40例，中位eVAF 0.049%，有25例(62.5%) eVAF＜0.1%，有12例(30%)为eVAF＜0.01%。
图3 治疗前ctDNA检测
总体上，通过这些检测，56%的患者(49/88)和26%的样本(94/363)检测到ctDNA，阳性样本的eVAF中位值为0.042%。
在随访观察阶段（治疗结束后2周后，包括MRD评估和随访阶段），血液ctDNA监测比临床影像学发现原发肿瘤复发的中位时间提前了7.1个月。在40份复发血液样本中，38份来自于18名首次原发肿瘤复发的患者；观察ctDNA检测对第一原发肿瘤复发的阳性预测值(PPV)为95%(38/40例阳性样本)，特异性为98.7%(150/152例)；在整个队列中，28名在观察期间收集的患者经历了第一个原发肿瘤的临床复发，28例患者中有18例(64.3%)检测到ctDNA，即治疗后ctDNA阳性率为64.3%。
图4 88名患者所有363个连续血浆样本的检测结果概况（红点ctDNA检测到，空心圈未检测到）
在MRD评估阶段，59名患者有MRD时间点收集的血浆样本，其中10名(17%)检测到ctDNA，并且所有10名患者的第一个原发肿瘤都复发了，即特异性和PPV都为100%；对复发的阴性预测值(NPV)为75.5%(37/49)，对复发/死亡的阴性预测值为65.3% (32/49)。同时，MRD是评估预后/复发风险的可靠指标，因为MRD阳性患者100%复发，MRD阴性复发率仅24.5%，整体MRD阳性率为17%。
在随访观察阶段，治疗后ctDNA长程动态监测可敏感预警肿瘤复发进展。
图5 基于MRD检测的生存分析
与基线时未检测ctDNA的患者相比，基线检测到ctDNA的患者的OS和RFS更短（HR分别为2.97和3.14，P值分别为0.01和0.003)。与治疗后观察期间任何时间点未检测到ctDNA的患者相比，检测到ctDNA的患者RFS显著缩短（HR 9.81，P值7e-10）。治疗前可检测到ctDNA且治疗后再次检测到ctDNA的患者比治疗后未检测到ctDNA的患者，复发/死亡风险增加了17.2倍（HR 18.2，P值2.2e-4）。
图6 治疗前后基于ctDNA检测的生存分析
结果显示，治疗前分别在24%、77%和87%的I期、II期和III期疾病患者中检测到ctDNA，在所有纵向监测样本中检测到ctDNA的比例为26%。检测到的肿瘤突变丰度中位数为0.042%。ctDNA检测的临床特异性＞98.5%，比临床影像学发现原发肿瘤复发的中位时间提前7.1个月。在原发肿瘤临床复发的患者中，在治疗后的ctDNA阳性率为64.3%。17%的患者在治疗结束后2周至4个月（MRD评估时间段）内检测到肿瘤突变，即MRD阳性，这些患者100%复发，且与更短的无复发生存期（HR 14.8, P＜0.00001)和总生存期（HR 5.48, P＜0.0003）相关。25%的患者在手术后1-3天检测到ctDNA，但与疾病复发无关。
总之，该研究增加了越来越多的证据，支持ctDNA检测用于检测残留疾病和复发。这可以作为一种敏感的工具，用于识别可能受益于额外辅助治疗或可能有资格参加临床试验的高复发风险患者。在未来，ctDNA检测可能允许识别复发风险较低的患者，对于这些患者，可能会考虑较低强度或较短的治疗疗程。早期NSCLC患者初始治疗后，使用高敏感性的方法特异性检测患者ctDNA，有望更早识别患者复发，以及确定可能受益于进一步干预治疗的患者。
目前，阔然基因已经布局依托于NGS测序平台的ctDNA液体活检技术MRD监测产品，肺癌及胃肠肿瘤MRD产品近期已经推出，不同于两种经典MRD检测策略（Tumor-informed和Tumor-naive），我们是采用WES+panel方案，同时兼顾两种经典检测策略优势，提供更全面的ctDNA系统解决方案，在实现超深度测序不漏检低频突变的同时，真正做到100%覆盖肿瘤患者。MRD产品价值体现在MRD评估、预后判断、预测复发、耐药性监测、指导治疗决策等方面，是被研究证实的优于传统影像学、血清学指标，具有更高灵敏度监测疾病复发的生物标志物。
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