近几年，基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)、二代测序(next generation sequencing, NGS) 等分子诊断技术的不断提升，以非固态生物组织为标本进行取样的液体活检技术发展迅速。
尿液作为液体活检体液样本来源之一，因其完全非侵入式采样、安全简单、无需特殊技术和仪器、样本体积量大和可多个时间点连续采样等独特优势，成为近年来液体活检领域的研究热点。近期， International Journal of Cancer 期刊在线发表了综述文章1，总结了尿液生物学标志物作为液体活检的研究现状，包括它们在多种癌症类型中检测、预后、监测和治疗反应方面的潜在临床应用。【肿瘤资讯】特此就尿液液体活检在乳腺癌中的潜在价值进行归纳总结，与各位读者分享。
液体活检概述
液体活检：主要通过PCR、高通量测序、酶联免疫吸附检测以及生物传感器等技术，对于原发性肿瘤在发生发展过程中分泌到人体外周体液中的各种组分进行测定和分析，从而完成对于恶性肿瘤的早期筛查、用药指导、病情进展评估和治疗效果观察等，可贯穿疾病诊疗的全程。
液体活检的优势：采用创新的微创技术，使得疾病诊断与治疗阶段的活检都更为简单、快捷，易于重复，可实现动态监测，且不受肿瘤异质性影响，能在一定程度上全面反映肿瘤整体变异状态。
液体活检大致可分为两大类：血液来源的生物标志物和其他来源的有临床诊断价值的生物标志物（例如：唾液、脑脊液、尿液、胸腹腔引流液等）。
尿液液体活检
来源泌尿系统和非泌尿系统的尿液生物标志物
尿液中DNA可分为两大类：异质的高分子量DNA（1kb或更高）和相对均质的低分子量DNA（10-250bp）。其中高分子量DNA源于泌尿系统，如膀胱、泌尿道、肾脏等组织器官中正常细胞或者病变细胞裂解后释放的DNA；另一类尿液细胞游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）则来源于非泌尿系统，如机体正常细胞、或肿瘤细胞凋亡和/或坏死等裂解后释放的cfDNA首先进入血液中，然后通过肾小球滤过膜进入尿液中。
乳腺癌尿液生物标志物相关研究
研究者分析了24篇有关乳腺癌尿液生物标志物有关的研究，涵盖了所有不同类型的分析物：如游离细胞或细胞DNA和RNA，细胞外囊泡，蛋白质和代谢物。其中约41.6%的研究分析尿液中的代谢物用以检测乳腺癌。
尿液DNA的提取和检测方法
大多数研究未介绍采用的尿液类型和保存方法，但33.3%的研究提到使用中段尿液（指在排尿过程中，弃去最初10-50 ml排出的尿液后采集，因其含有相对较少的污染物，故被认定为检测代谢性疾病和尿路感染的标准尿样）。代谢物或蛋白质的研究多采用固相萃取法进行分离，采用质谱或高效液相色谱法进行检测。对于尿液中的DNA，大多数研究人员使用QIAGEN公司的市售分离试剂盒和ddPCR作为检测方法。尿液生物标志物似乎很有前景，其敏感性为66.7% ~ 98.6%，特异性为66.1% ~ 100.0%。
研究分析
其中三项研究表明，尿液中的循环肿瘤DNA （ctDNA）诊断结果与组织活检结果具有高度一致性(97.2% ~ 97.3%)2。进一步研究发现，ctDNA可用于疾病进展和复发的常规监测。两个独立的研究小组表明，8-氧代-7,8-二氢-20-脱氧鸟苷(DNA 氧化损伤生物标志物)的浓度在早期乳腺癌和非癌症对照组(良性乳腺疾病和健康对照组)之间存在显著差异3。另一组研究人员则通过尿液EV miRNA完成了乳腺癌患者和健康对照组的鉴别诊断，敏感度和特异性分别达91.7% ~ 98.6% 和91.7% ~ 100.0%4。
此外，一些研究表明了尿蛋白和代谢产物的研究潜能，并进一步优化和提升了其分析技术。Beretov等确定了一种由13种上调蛋白组成的panel用于检测。结果显示，与健康对照组相比，乳腺癌患者中有59种尿蛋白表达存在差异，其中36种具有临床分期特异性5。核酸氧化生物标志物与包括癌症在内的多种疾病有关，近年来引起了越来越多的关注。Zahran等将血清C15-3与1-甲基腺苷、1-甲基鸟苷和8-羟基-20-脱氧鸟苷联合使用提高了乳腺癌诊断敏感度 ，在验证队列中的AUC 高达 0.973，提示这些氧化核酸修饰可作为早期乳腺癌诊断的潜在无创标志物6。
Huang等证实了内源性雌激素及其代谢途径与雌激素诱导的乳腺癌风险的癌变相关，并进一步研究了依西美坦治疗对患者雌激素生成的影响7。Zhao等则通过开发一种用于分离和检测六种尿蝶啶的技术，进而证明乳腺癌患者的异黄蝶呤和黄蝶呤这两种碟啶代谢产物在尿液中的水平明显高于健康对照组，提示两者可能具有诊断和疗效检测作用8。
2012年，Silva等使用固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术，对乳腺癌患者的挥发性有机代谢组(VOM)概况与健康对照组进行了比较。研究发现6种VOMs在患者和健康对照组之间有统计学差异，并持续对该分析技术不断进行优化。其2019年更新的结果提示了识别内源性代谢物作为发现潜在乳腺癌生物标志物平台的可能性。不仅如此，该课题组在2019年还明确了H-NMR作为识别乳腺癌患者尿代谢组学模式的诊断方法9,10。
总结
在检索的文献中，大多数研究人员未对尿液类型、样本采集、储存和处理的详细信息予以说明。此外，研究者采用的分析物类型，样品的分离、提取、检测和分析方法各异。因此，基于泌尿生物标志物敏感性和特异性的荟萃分析面临挑战。未来研究人员应正确、全面地报告所有信息，使用标准参数清单或模板，进一步阐明统一的测试条件，以产生可重复的和可靠的结果，为其在临床上的使用建立标准化方案。尿液可以作为一种多组学样本类型，涵盖DNA、RNA、蛋白质、代谢物和金属元素可能蕴藏着比血液更加丰富的肿瘤信息，具有革新乳腺癌诊断和动态监测乳腺癌的潜能。
近几年来，非血液来源液体活检在乳腺癌中的研究发展迅速，但与基于血液来源的液体活检相比，尿液在非泌尿系统肿瘤液体活检领域的潜力还未得到充分的探索。目前尚缺乏公认的尿液ctDNA提取和检测标准。不同的提取方法或检测方法对于同一个样本或许会得出不同的结果。而且尿液DNA的检测方法大多使用ddPCR和NGS，这2种方法虽具有极高的检测灵敏度，但是成本高且耗时长。未来对于乳腺癌尿液液体活检的研究可集中在样本收集、储存和处理的标准实践方案的确立，以进一步探索尿液在乳腺癌筛查、早期检测以及治疗监测方面的临床应用。
1. Jordaens S, Zwaenepoel K, Tjalma W, et al. Urine biomarkers in cancer detection: A systematic review of preanalytical parameters and applied methods. Int J Cancer. 2023 Jan 16. doi: 10.1002/ijc.34434. Epub ahead of print. PMID: 36647333.
2. Zhang, J., X. Zhang, and S. Shen, Treatment and relapse in breast cancer show significant correlations to noninvasive testing using urinary and plasma DNA. Future Oncol, 2020. 16(13): 849-858.
3. Loft, S., et al., Association between 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine excretion and risk of postmenopausal breast cancer: nested case-control study. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2013. 22(7): 1289-96.
4. Hirschfeld, M., et al., Urinary Exosomal MicroRNAs as Potential Non-invasive Biomarkers in Breast Cancer Detection. Mol Diagn Ther, 2020. 24(2): 215-232.
5. Beretov, J., et al., Proteomic Analysis of Urine to Identify Breast Cancer Biomarker Candidates Using a Label-Free LC-MS/MS Approach. PLoS One, 2015. 10(11): e0141876.
6. Zahran, F., et al., Study on Urinary Candidate Metabolome for the Early Detection of Breast Cancer. Indian J Clin Biochem, 2021. 36(3): 319-329.
7. Huang, J., et al., Analysis of multiplex endogenous estrogen metabolites in human urine using ultra-fast liquid chromatography-tandem mass spectrometry: a case study for breast cancer. Anal Chim Acta, 2012. 711: 60-8.
8. Zhao, Y., et al., Liquid chromatography tandem mass spectrometry determination of free and conjugated estrogens in breast cancer patients before and after exemestane treatment. Anal Chim Acta, 2014. 806: 172-9.
9. Silva, C.L., et al., Untargeted Urinary (1)H NMR-Based Metabolomic Pattern as a Potential Platform in Breast Cancer Detection. Metabolites, 2019. 9(11).
10. Silva, C.L., M. Passos, and J.S. Câmara, Solid phase microextraction, mass spectrometry and metabolomic approaches for detection of potential urinary cancer biomarkers--a powerful strategy for breast cancer diagnosis. Talanta, 2012. 89: 360-8.
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