急性淋巴细胞白血病（ALL）在临床表现、生物学背景、临床病程、预后等方面均属异质性恶性肿瘤。B细胞来源的ALL（成人75~ 80%，儿童85~90%）比T细胞来源的ALL（成人20~25%，儿童10~15%）更为常见。ALL是儿童最常见的肿瘤，也影响所有年龄段的成人患者：2 - 5岁和≥50岁，60%的病例发现于≤20岁的患者中。基于治疗方式的不断演变，ALL的5年总生存（OS）率逐渐提高，但约20%的ALL患儿仍会复发，成人患者的复发风险更是高达50%。
微小残留疾病（MRD）的是指在任何特定治疗后，剩余癌细胞在其他正常骨髓中或在循环血细胞中所占的比例。在ALL中，MRD监测已被证实为独立的预后因素和进行治疗决策的重要工具。相关研究证实治疗前3个月的MRD测量对儿童ALL患者的风险组分配最有价值，缓解后阶段的MRD监测在成人ALL患者中应用更为广泛。
本综述将重点介绍新兴分子技术如何改进ALL中MRD的分子监测，并克服标准方法的一些局限性。
IG/TR基因重排与融合基因转录
IG/TR基因重排
>95%的ALL患者中可以检测到IG/TR基因的克隆重排，IG/TR基因重排是MRD分析中最常用的标记物。为了在疾病诊断时即识别上述分子标志物，可对从白血病细胞中提取的基因组DNA进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，通过标准Sanger测序确定克隆PCR片段的连接区域，并获得互补等位基因特异性寡核苷酸（ASO）引物用于MRD监测，主要通过实时荧光定量（RQ）-PCR进行测定。值得注意的是，由于生物学（细胞成熟期）和技术原因，RQ - PCR并不能在所有患者中监测MRD，失败率约为5 - 10%。此外，IG/TR基因重排可能在治疗过程中发生改变，从而可能导致MRD假阴性结果。上述改变可能是由于克隆进化或正在进行的二次重排过程。
RQ - PCR的使用可能受限于足够可用的诊断材料，因为该方法基于与基于疾病发作时所收集肿瘤DNA的标准曲线的比较；这可能会限制长时间监测患者的可能性。此外，MRD水平非常低的一部分患者被归类为阳性不可量化（PNQ），这主要因为虽然MRD结果为阳性，但与RQ - PCR测定的标准曲线相比，该结果在定量范围之外被检测到。更好地区分这些病例在临床实践中是一个挑战，特别是当使用MRD数据指导治疗决策时。
融合基因转录
约40%的ALL患者检测到染色体易位，这些基因突变是MRD评估的理想靶点，因为这些基因突变是白血病细胞所特有的，并且在疾病病程中非常稳定。尽管产生的RNA转录的数量有很大的可变性，但并不非所有融合基因都适合进行MRD评估。在缺乏合适的MRD标记物的情况下，应检查替代靶点。考虑到剪接过程在所有患者中产生相同的融合转录本或一些剪接变体，RNA是检测基因异常的更好材料。因而，少量的RQ - PCR检测便足够。
使用融合基因作为分子标记物的MRD评估在建立在细胞系或质粒DNA连续稀释的标准曲线上进行（如BCR - ABL1+）。达到的敏感范围约为1个白血病细胞/100,000(10-5)个正常淋巴样细胞。尽管该监测方法快速且应用简便，但其准确性因RNA转录本的可变性而改变。
MRD监测的新分子技术
微滴式数字聚合酶链式反应（ddPCR）
ddPCR似乎是MRD评估的一种可行、新颖的替代方法。基于易于使用、适用性强、适应性强、节省时间的特点，目前已经开发了几种ddPCR系统。在MRD评估方面，RQ – PCR所观察到的不一致性主要在较低的疾病水平下降。而ddPCR在定量RQ – PCR - PNQ样本和识别假阳性病例方面的强壮性已在几种血液系统恶性肿瘤中报道。
相关研究数据表明，在ALL中，当RQ - PCR的定量范围低于10-4时，ddPCR具有更高的扩增效率和重现性，是一种非常准确的工具。此外，联合使用新技术可以更好地区分经标准方法无法检测或量化疾病水平的低阳性样本。
对于Ph+ ALL，已有3项研究采用ddPCR进行MRD监测：
①Iacobucci等开展的研究证实，ddPCR检测疾病的敏感性与常规方法相当；
②Coccaro和colleagues等开展的研究证实，p190的ddPCR检测能够通过在不同孔中加载大量cDNA并结合多个重复的计数来量化低疾病水平；
③Ansuinelli和colleagues等开展的研究证实，ddPCR能够显著降低PNQ样本率，增加可量化样本比例（46%，p < 0.0001）。
此外，一项在ALL患者的儿科队列中进行的研究显示，ddPCR MRD定量在特定时间点（即第+78天）与复发相关，与之相对应，同一时间点的ddPCR MRD阴性或PNQ结果与更好的结局呈正相关，突出了该方法的可能临床意义。但目前尚没有ddPCR MRD应用指南。
图1.ddPCR技术
二代测序（NGS）
NGS方法是一种非常复杂的分析方法，能够提供大量的数据。多年来，已经开发了几种不同用途的测序技术：全基因组测序（WGS）、转录组测序（RNA-seq）、全外显子组测序（WES）和靶向基因测序。此外，科学家正致力于确定NGS技术所识别的基因组病变是否可以用于MRD监测。基于NGS具有较高的灵敏度，与标准方法相比，NGS可以识别更多的基因重排。譬如，寡克隆性是ALL的一个众所周知的现象并阻碍了常规的IG/TR MRD评估，但NGS可以更好地识别寡克隆性。
ALL中的多个IG/TR基因重排来自于持续重排过程和次级重排。相关研究报道了使用IG/TR基因重排法对NGS和RQ-PCR进行比较分析，结果表明两种方法相关性较好，但NGS在MRD定量方面的敏感性和特异性更高。重要的是，NGS分析没有将病例定义为PNQ，因为NGS与标准方法不同，其定量范围总是与敏感范围重叠。此外，与标准方法相比，NGS检测在肿瘤负荷较低的病例中显示出更好的检测能力，允许更高分辨率的克隆重排部分隐藏于多克隆背景中。但目前国际上还没有关于NGS MRD分析的指南。
总而言之，与标准方法相比，NGS用于MRD监测的更高敏感性、特异性和应用使其在临床实践中的实施成为接下来要实现的最重要目标之一。然而，需要有熟练的生物信息学。
图2.NGS分析
本综述认为，ddPCR和NGS的联合使用显著减少了经RQ - PCR定义为PNQ的关键样本数量，但ddPCR和NGS联合使用在临床实践中是一个挑战，并显示出与MRD定量的高度一致性。
MRD监测的新参数
游离核酸（cfDNA）和微小RNA（miRNA）
循环核酸（cfDNA和miRNA）已在实体癌和非霍奇金淋巴瘤中进行研究，目前正在ALL中进行研究。
Schwarz及其同事们进行了一项研究，旨在检测使用来自于ALL儿童的cfDNA进行MRD测量的可行性。结果显示，尽管浓度较低，cfDNA是测量ALL诱导治疗中MRD动力学的可行工具。
Cheng等人评估了IG/TR基因重排量化cfDNA检测MRD的可行性，并将其与BM流式细胞术分析进行了比较。该研究不仅表明了cfDNA作为白血病患者治疗监测工具的可行性，且证明了cfDNA的预后意义。
图3.cfDNA作为ALL患者MRD监测的新参数
循环肿瘤细胞（CTC）和外泌体
动物模型和癌症患者的研究都表明，CTC具有促进早期检测、预后、治疗靶点选择和治疗应答监测的潜力。与cfDNA和miRNA相比，CTC和外泌体在其他血液疾病中也有应用，如淋巴瘤、多发性骨髓瘤（MM）和慢性淋巴细胞白血病（CLL），一些研究对CTC和外泌体在ALL中的应用进行了探索。
总而言之，虽然液体活检是一种非常有吸引力的工具，但必须记住，一些分析前因素会影响循环肿瘤DNA（ctDNA）的数量和质量，因此目前阻碍了分子分析的使用，并强调需要制定标准化的方案，以改善血浆样本处理过程中分析前步骤可变性的影响，并在技术层面上允许准确、可靠和可重复的ctDNA基因分型和定量结果。
研究结论
MRD是儿童和成人ALL预后的一个强大且独立的预测指标。MRD可以根据不同检测时机提供不同的信息：治疗早期，诱导/巩固后，或干细胞移植（SCT）前后。当前，IG/TR基因重排和基因融合的RQ - PCR是应用最为广泛和巩固的分子MRD监测方法。然而，尽管这种方法具有广泛的适用性，但也有其固有的局限性，必须加以克服。ddPCR和NGS似乎是MRD评估的可行且新颖的替代方法，比标准方法更敏感和准确，可以通过RQ - PCR分析更好地区分关键样本，特别是在某些亚组中（如早期T - ALL和pro - B - ALL，此类亚组通常缺乏敏感的分子标记物）。鉴于其内在的技术特点，ddPCR和NGS的联合使用几乎可以为所有患者提供准确的MRD分析。
在过去的几年中，探索ctDNA作为一种非侵入性、实时和敏感工具的可能性引起了学界的广泛关注。事实上，ctDNA可以提供更为全面的特定肿瘤遗传异质性的分子概述，并有可能在疾病病程中进行连续的血液检测。然而，为了证明ctDNA用于监测恶性血液疾病患者MRD的可行性和可重复性，需要克服一些影响分析的分析前偏差。
MRD分析代表着制定ALL治疗方案的主要工具，并正逐渐变得更加完善，且始终致力于更深刻地根除疾病并治愈更多患者。
需要关注的是，全部年龄段ALL患者的管理总是越来越多地由实验室驱动，从诊断和预后检查到疾病不同阶段的MRD密切监测，进而导致越来越个性化的治疗策略。这在全球范围内可行吗？这方面不容忽视，因为这种复杂方法对于为ALL患者提供最佳管理并增加治愈可能性至关重要。
Irene Della Starza, et al.Optimizing Molecular Minimal Residual Disease Analysis in Adult Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancers (Basel). 2023 Jan 6; 15(2): 374.
排版编辑：Luna
苏公网安备32059002004080号
