共价BTK抑制剂，包括目前已经上市的伊布替尼、泽布替尼、阿卡替尼、奥布替尼。作用机制相同，都是通过与BTK的C481残基结合，阻断ATP结合口袋，抑制BTK酶的活性从而发挥减少恶性B细胞增殖的作用。在这些BTK抑制剂使用中均发现获得性C481突变产生的耐药。而非共价BTK抑制剂不与C481结合，因此为B细胞恶性肿瘤患者（包括对共价BTK抑制剂产生耐药性的患者）提供了一种潜在的有效选择。
第64届美国血液学会（ASH）年会已于2022年12月10日~13日盛大召开。ASH作为全球血液学领域最具规模的国际盛会，每年都会公布和发表世界各国的最新血液学进展，汇集各国知名血液病学专家，分享全球最前沿的研究进展和突破性临床数据。在本次大会中公布了诸多BTK抑制剂相关的研究成果，【血液肿瘤资讯】特此精粹汇总，让我们共同聚焦BTK抑制剂领域的前沿进展！
摘要号750：激酶死亡BTK突变导致对共价和非共价BTK抑制剂的耐药性，但对临床阶段BTK降解物敏感
研究介绍
尽管接受共价BTK抑制剂治疗的CLL患者预后良好，但许多患者最终因C481突变而产生耐药性。非共价BTK抑制剂（如Pirtobrutinib）对C481突变表现出良好活性，但对其他BTK突变敏感，例如L528W、V416L、M437R和T474I突变，其中大多数也对共价BTK抑制剂产生耐药性。
研究结果
尽管BTK耐药突变阻碍了联合治疗，但研究者观察到，L528W、M437R和V416L的耐药性替代使BTK的酶活性失效，但仍能启动B细胞受体（BCR）信号转导，表明存在非酶活性或支架活性。全长野生型（WT）BTK和8种不同BTK突变蛋白的体外激酶试验显示，BTK C481R、C481F、L528W和V416L几乎完全没有激酶活性（图1）。虽然BTK C481R/F突变最近被证明是激酶死亡的，但这些突变蛋白仍然依赖于PLCγ2 Y1217（活化BTK的下游底物）的磷酸化。相反，BTK L528W、M437R和V416L突变以一种独立于PLCγ2 Y1217磷酸化的独特方式促进BCR信号传导。与上述结果一致，在BTK敲除的DT40细胞中，L528W、M437R和V416L突变的表达未能导致BTK Y223自身磷酸化或PLCγ2磷酸化。
尽管有上述发现，BTK激酶死亡突变体在IgM刺激后增强了BCR下游的信号传导，完整激活AKT、ERK和过度激活的钙释放。BTK抑制剂耐药CLL细胞的单细胞转录组学分析显示BCR转录信号、NFκB和IKZF2/3靶基因的上调。
为了了解激酶死亡BTK突变体如何增强BCR信号传导，研究者在表达WT或激酶死亡BTK L528W的BTK依赖性人类B细胞淋巴瘤细胞中进行了整体磷酸蛋白质组学、kinobead试验和BTK免疫沉淀质谱研究。总的来说，这些研究揭示了BTK L528W与LYN和HCK的独特物理相互作用，以及与WT BTK相比，这些激酶及其磷酸化底物的激活。这表明，PLCγ2非依赖性BTK激酶死亡突变体通过突变体BTK的支架功能绕过BTK/PLCγ2激活BCR信号。
为了解决这些突变BTK蛋白中缺乏酶活性的问题，研究还探索了消除而不是酶抑制BTK的方法。研究生成了NX-2127，一种有效的、异双功能的、口服生物可利用的降解分子，它使BTK和IKZF蛋白与E3连接酶接头蛋白cereblon紧密接近，触发它们的泛素化和随后的降解。重要的是，通过基于FRET的生化试验显示，NX-2127诱导CRBN和WT BTK以及BTK C481S和T474I突变体的复合物形成。事实上，NX-2127以相似的结合亲和力结合WT和守门人BTK T474I突变体。与此一致，NX-2127促进WT BTK和每个复发耐药突变体（BTK C481S、L528W、V416L、T474I和M437R）的剂量依赖性降解。此外，WT以及BTK突变体的降解阻断了BCR信号传导的IgM依赖性刺激。
基于上述发现，启动了一项NX-2127治疗复发/难治性B细胞恶性肿瘤的首次人体Ⅰ期试验 （NCT04830137）。1例携带BTK C481R突变的典型CLL患者在伊布替尼和维奈克拉治疗后发生疾病进展，然后接受Pirtobrutinib治疗，并发生BTK L528W突变。NX-2127治疗使血细胞计数正常化，并抑制BTK C481R和L528W突变克隆，与CD19+ B细胞中> 90%的BTK和IKZF1降解一致（图1）。
结论
这些发现揭示了耐药BTK蛋白迄今未被认识的功能，使BTK酶促死亡，但保留了通过绕过PLCγ2的支架功能刺激BCR信号传导的能力。重要的是，在临床上对共价和非共价BTK抑制剂耐药时出现的每种复发性BTK突变均对本文所述的新发现的临床阶段BTK降解化合物敏感，目前正在有或无BTK突变的CLL患者中进行Ⅰb期剂量扩展试验。
图1
摘要号1359：导致非共价BTK抑制剂耐药的新型BTK突变和替代治疗策略
研究介绍
目前对非共价BTK抑制剂的耐药机制尚未完全阐明。最近，Wang E等人（NEJM 2022）在对非共价BTK抑制剂Pirtobrutinib耐药的患者中发现了新的BTK突变。在此，本研究生成并全面表征了对伊布替尼耐药以及5种不同的非共BTK抑制剂，即Pirtobrutinib（LOXO-305）、vecabrutinib（SNS-062）、nemtabrutinib（ARQ-531）、fenebrutinib（GDC-0853）和RN-486的BTK和PLCG2突变。
研究结果
使用多个平行的套细胞淋巴瘤REC-1细胞株，进行长期体外剂量递增方法以产生耐药性。选择REC-1是因为其对BTK抑制剂高度敏感。采用靶向下一代测序鉴定BTK和PLCG2的获得性突变。虽然用伊布替尼长期处理的所有六个REC-1细胞系均获得了C481F BTK突变，但在对非共价BTK抑制剂耐药的细胞中，研究者确定了BTK的六个不同突变[变异等位基因频率（VAF）22%~99%]和PLCG2的三个突变（VAF 10%，30%和53%）。6个对vecabrutinib耐药的REC-1细胞系中有4个获得BTK G409R突变，而1个细胞系获得L845F PLCG2突变。在对fenebrutinib耐药的三个独立REC-1细胞系中发现了三种不同的BTK突变，即L528S、G480R和D539H。RN-486耐药的REC-1细胞在三个不同的细胞系中的两个获得G480R和V416L BTK突变。6个Pirtobrutinib耐药细胞系中有1个获得BTK A428D突变，而另外2个耐药系获得R727L和S1079R PLCG2突变。有趣的是，在REC-1 细胞系中也发现了3个BTK残基A428、L528和V416的突变（据报道这些突变可介导CLL患者的Pirtobrutinib耐药），这些细胞系分别对Pirtobrutinib、fenebrutinib和RN-486产生耐药性。值得注意的是，尽管IC50增加，但耐nemtabrutinib的REC-1细胞未获得BTK或PLCG2突变，表明其他机制在耐药性产生中的作用。
为了从功能上分析不同BTK突变体REC-1细胞的BCR信号传导能力，研究者在用抗IgM刺激后进行了细胞内[Ca2+] ([Ca2+]i)的测量。除A428D外，与WT细胞相比，所有BTK突变REC-1细胞系均显示相似或增强的[Ca2 +]i。免疫印迹分析显示，与WT相比，在所有不同的BTK突变细胞系中，抗IgM介导的BTK活化减少。然而，在所有突变系中磷酸化AKT的下游活化增强，与早期报道相似，而磷酸化ERK水平变化很小。此外，通过研究BTK突变细胞对一组9种不同共价和非共价BTK抑制剂的敏感性，研究确定G409R和D539H突变体对共价 BTK抑制剂敏感，而其他BTK突变体对共价和非共价BTK抑制剂均耐药。
BCL-2抑制剂维奈克拉是CLL的重要治疗选择，然而，在非共价BTK抑制剂耐药的情况下，对维奈克拉的反应尚不清楚。进行了基于流式细胞术的BH3分析试验，以研究BTK突变体中的凋亡启动。除G409R外，所有BTK突变体均显示BAD肽暴露的凋亡启动增加，表明与WT相比，BCL2依赖性增强。与此一致，非共价BTK抑制剂耐药REC-1细胞在体外显示对维奈克拉的敏感性增强，而G409R BTK突变体具有与WT相似的IC50。
结论
总之，研究确定了对非共价BTK抑制剂耐药的新型BTK蛋白激酶结构域突变。该发现强调了在非共价BTK抑制剂治疗进展的情况下对BTK的所有外显子或至少激酶结构域（外显子13-19）进行测序的重要性。研究者还发现，携带这些新的BTK突变的细胞对共价和非共价BTK抑制剂表现出不同的敏感性。此外，进一步证明了维奈克拉作为非共价BTK抑制剂耐药后续治疗的潜力。
摘要号1792：导致对第二代不可逆BTK抑制剂奥布替尼耐药的新型BTK突变
研究介绍
奥布替尼（ICP-022）是一种新型、高选择性的不可逆BTK抑制剂，在R/R CLL/SLL的Ⅰ/Ⅱ期试验中表现出良好的安全性和疗效特征。然而，奥布替尼的耐药机制尚未见报道。
研究方法
NCT03493217中，在奥布替尼进展患者的可用系列样本中采用深度靶向基因下一代测序（NGS）评估覆盖BTK（外显子1-19）、PLCG2（外显子1-33）和使用高灵敏度液滴数字PCR（ddPCR）检测BTK Cys481突变。
研究结果
该研究共确定了本研究队列中接受奥布替尼治疗后进展的6例患者，从奥布替尼开始治疗至发生耐药的中位时间为31个月。3例患者因淋巴结肿大而出现进展，而其他3例患者因外周血CLL计数增加而出现进展（图2.A）。深度靶向基因NGS显示，6例患者中有5例检测到BTK突变（83.3%，图2.B）。值得注意的是，在奥布替尼治疗期间疾病进展的2例患者中检测到BTK激酶结构域突变BTK Thr474Ile（NM_000061.2：exon15：c.1421C > T：p.T474I）。在其他3例接受奥布替尼治疗后疾病进展的患者中发现BTK Cys481突变，其中1例患者同时携带BTK Cys481Arg（NM_000061.2：exon15：c.1441T > c：p.C481R）和BTK Leu528Trp（NM_000061.2：exon16：c.1583T > G：p.L528W）。在同时携带BTK C481R和BTK L528W的患者中，BTK L528W的变异等位基因频率（VAF）显著高于BTK L528W（中位BTK L528W 9.16%vs. BTK C481S 3.45%）。用ddPCR评估BTK Cys481突变证实了上述结果。
对开始奥布替尼治疗前和奥布替尼耐药后的6例患者进行了纵向NGS分析，突变情况如图2.C所示。奥布替尼耐药后，在开始奥布替尼治疗前2例患者（其中1例携带TP53缺失）中检测到的TP53突变仍然存在，而在奥布替尼开始治疗前TP53缺失的1例患者进化出了新的TP53突变克隆。
结论
总体而言，该研究首先描述了接受奥布替尼治疗后进展的CLL患者中发生的BTK突变。发现BTK T474I和BTK L528W富集，揭示其不同于第一代BTK抑制剂伊布替尼的耐药机制。此外，据报告，BTK T474I和L528W可导致对LOXO-305耐药，而伊布替尼可部分克服BTK T474I和L528W引起的耐药，提示奥布替尼耐药后的不同治疗选择。
图2
摘要号2663：BTK降解物Nx-2127在对共价BTK抑制剂敏感或耐药的MCL细胞中表现出致死活性以及与维奈克拉和BET蛋白抑制剂的协同作用
研究简介
BTK是一种Tec家族成员、非受体、酪氨酸激酶，在MCL细胞、BCR、Toll样受体（TLR）和Fc受体的下游具有组成型活性。BTK在细胞周期进程和B细胞活化中起关键作用。在小鼠模型中，功能丧失和激酶死亡突变体的BTK显示B细胞成熟受损。BTK激活多种促生长和促存活机制，涉及PLCγ2活性、RAS-RAF-MEK-ERK通路和NFκB转录活性。
共价BTK抑制剂，包括伊布替尼和阿卡替尼，不可逆地与BTK激酶结构域中的C481结合，抑制生长，并诱导MCL细胞丧失活力。尽管共价BTK抑制剂治疗可诱导显著的临床缓解，但在大多数患者中观察到对BTK抑制剂的固有和获得性耐药。MCL细胞中的BTK抑制剂耐药性归因于TRAF2、BIRC3或MAP3K14突变、功能获得CARD11突变、CCND1突变和MYC活化引起的替代NFκB信号转导的激活。C481S BTK突变的出现引起BTK抑制剂与C481共价结合的空间位阻，导致获得性耐药，随后在CLL中出现临床复发，在MCL中较少见。然而，这种情况仍然强调了MCL细胞生长和存活对BTK信号传导的依赖性。它还支持在MCL细胞中使用BTK降解剂降解和消耗BTK（包括C481S-BTK）的策略。
NX-2127和NX-5948是有前景的、基于cereblon的、口服生物可利用的临床级BTK降解剂，可降解和消耗BTK水平。在目前的研究中，研究者确定人MCL细胞[包括MCL细胞系：REC1、Mino和JeKo-1以及患者源性（PD）MCL细胞]体外暴露于NX-2127（10~250 nM）2~24小时可通过蛋白酶体降解显著耗尽BTK水平，因为与蛋白酶体抑制剂卡非佐米联合治疗可恢复BTK水平。NX-2127而不是NX-5948处理也降解和耗尽了IKZF1和IKZF3水平。然而，两种BTK降解物也耗尽了BTK1耐药Mino-IR和Jeko1-IR细胞中的BTK水平[在重复暴露于高水平伊布替尼（即30 μM，48小时）后显示出诱导的体外耐药性]。NX-2127处理降低了MCL细胞中IL-10和TNFα的mRNA水平。此外，NX-2127介导的BTK耗竭与Mino、Mino-IR以及PD MCL细胞中p-PLCγ2（Y1217）、p-AKT、pERK1/2和SOX11蛋白水平的下游降低相关。值得注意的是，NX-2127处理也显著耗尽了CLL细胞中对共价BTK抑制剂产生临床耐药性的C481S-BTK的蛋白水平。暴露于NX-2127剂量依赖性地抑制REC1、Mino、JeKo-1、Mino-IR、JeKo-1-IR细胞以及PD MCL细胞的生长和存活。
先前已经报告了BET蛋白抑制剂和/或BCL-2抑制剂（维奈克拉）在MCL细胞模型中诱导体外致死性。基于此，本研究中测定了NX-2127和维奈克拉或BD2选择性、BET蛋白抑制剂 ABBV-744在MCL细胞中的协同致死活性。与NX-2127（10~100 nM）和低nM水平的维奈克拉或ABBV-744联合处理对MCL细胞具有协同致死性（通过ZIP方法的δ协同得分高于1.0）。
总的来说，这些发现表明，NX-2127治疗可降解和减弱BTK和IKZF1/3水平，以及抑制下游促生长和促生存信号传导，导致MCL细胞的活力丧失，包括对共价BTK抑制剂治疗耐药的细胞。这些结果还显示，基于NX-2127与BCL-2或BET抑制剂的联合治疗具有良好的抗MCL活性，值得进一步进行体内研究验证。
摘要号3102：对非共价BTK抑制剂Pirtobrutinib的耐药性
研究介绍
为了研究Pirtobrutinib的疾病进展机制，本研究在治疗前和治疗后患者样本（n=5）中评价了体外Pirtobrutinib对BCR通路的影响，并在其中2例患者中，研究者对Pirtobrutinib进行了纵向全外显子测序，包括Pirtobrutinib治疗前和复发时。
研究方法
使用PhylogicNDT和Concerti工具评估与耐药性相关的系统发育和亚克隆动力学。为了研究已鉴定的BTK突变对BCR活化的影响，研究者使用定点诱变生成了6个单突变体和3个双突变体，并在BTK缺失的DT40 B细胞系中表达。
研究结果
研究证明，试验中对Pirtobrutinib产生缓解的患者的原代CLL细胞显示，Pirtobrutinib可降低BCR信号传导，减少CCL3/CCL4趋化因子分泌，以及有效诱导细胞凋亡和抑制增殖。在出现进展时，这些原代CLL细胞在信号抑制和细胞因子产生方面显示对Pirtobrutinib的耐药性增加，而增殖抑制和凋亡诱导减少。
在WES分析中，在阿卡替尼、vecabrutinib和Pirtobrutinib治疗前、治疗期间和复发时评估了1号患者的16份样本。对阿卡替尼治疗期间采集的样本进行克隆分析，结果显示稳定选择了携带BTK p.C481S突变的克隆，复发时CCF为92%，但在Pirtobrutinib治疗期间稳步下降。Concerti的时间尺度系统进化树显示，在阿卡替尼治疗期间，包含BTK门控突变p.T474I的新克隆的诞生，然后在Pirtobrutinib治疗下快速生长，几乎接管了整个癌细胞群，取代了之前的p.C481S克隆。Pirtobrutinib治疗期间的这种完全克隆转变表明，Pirtobrutinib可有效抑制p.C481S克隆，而p.T474I门卫克隆很可能驱动该患者的耐药性。还观察到另一个门卫克隆BTK p.T474L在低水平发展，以及另一个以前未描述的BTK突变在p.M477I。人工检查显示BTK突变p.M477I和p.T474I为顺式，因此在同一个克隆中。
在伊布替尼和Pirtobrutinib治疗前、治疗期间和复发时评估了2号患者的10份样本。在伊布替尼治疗期间，可以观察到TP53 p.S240G和SF3B1 p.K666N突变克隆稳定增加，伊布替尼复发时CCF > 40%。研究者还注意到，在伊布替尼治疗进展时，BTK p.C481R（CCF 33%）、BTK p.C481S（CCF 11%）和TP53 p.R196* （CCF 5%）显著增加。在Pirtobrutinib治疗下，携带BTK p.C481R的克隆降至CCF 20%，而BTK p.C481S（28%）和TP53 p.R197*（35%）均增加。Concerti的系统发育树捕获了一个耐药克隆的诞生，包含BTK p.L528W，其在Pirtobrutinib治疗进展时显著增加至CCF 30%。
已鉴定的BTK突变的功能特性鉴定表明，仅T474I、T474L和C481S突变体显示足够的激酶活性，而根据BTK Y223和PLCG2 Y753磷酸化判断，所有其他突变体（包括M477I、C48IR和L528W）基本缺乏激酶活性。正如预期，C481S变体对伊布替尼耐药，但对Pirtobrutinib不耐药，而T474I/L变体对伊布替尼敏感，但对Pirtobrutinib耐药。有趣的是，AKT和ERK的磷酸化保留在下游，即使突变不能激活近端BCR信号。此外，在缺乏内源性BTK的B7.10细胞系中也观察到AKT和ERK磷酸化，表明这些通路的显著激活与BTK无关。
在这项研究中，证明了随着CLL患者开始发生疾病进展，Pirtobrutinib的体外疗效下降，与导致Pirtobrutinib耐药的看门和替代位点BTK突变的发展一致。有趣的是，许多第二位点BTK突变不能激活BTK磷酸化，但仍与磷酸化-AKT和磷酸化-ERK的下游激活相关，这种激活的机制仍有待阐明。
摘要号3114：野生型和C481S-突变BTK抑制剂Nemtabrutinib治疗B细胞恶性肿瘤的疗效和安全性：开放性Ⅰ/Ⅱ期剂量扩展Bellwave-001研究的更新分析
研究介绍
nemtabrutinib（MK-1026，ARQ-531）是一种非共价的、野生型、伊布替尼耐药C481S突变体BTK的强效抑制剂。Ⅰ/Ⅱ期BELLWAVE-001研究（NCT03162536）的初步结果显示，nemtabrutinib在既往接受过大量预治疗的R/R CLL/SLL患者（包括既往共价BTK抑制剂治疗后疾病进展的患者）中具有可管理的安全性特征和有前景的抗肿瘤活性。本研究提供了接受nemtabrutinib 65 mg治疗的所有CLL/SLL患者的更新疗效数据，以及接受nemtabrutinib 65 mg剂量治疗的所有血液恶性肿瘤患者的安全性数据。
研究方法
在这项开放标签、单组、Ⅰ/Ⅱ期研究中，在确定初步nemtabrutinib推荐2期剂量（RP2D）后，启动了9个扩展队列。符合条件的CLL/SLL患者分别入组队列A（R/R CLL/SLL，既往接受过≥2种治疗，包括共价BTK抑制剂，有C481突变记录）、队列B（既往接受过≥2种治疗，对BTK抑制剂不耐受，无C481突变）、剂量扩展组或队列I（食物效应）。
主要研究终点为ORR、安全性和RP2D。次要研究终点为DOR[包括淋巴细胞增多的PR（PR-L）]、PFS和安全性。
研究结果
共有112例患者入组并接受nemtabrutinib 65 mg每日一次治疗：57例患有CLL/SLL，46例患有B细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL），6例患有华氏巨球蛋白血症，3例被诊断为“其他”。在入组并接受nemtabrutinib 65 mg治疗的57例CLL/SLL患者中（队列A，n=25；队列B，n=10；剂量递增队列，n=13；队列I，n=9）。中位年龄为66.0岁。既往治疗的中位数为4（1~18）。
在CLL/SLL患者中，39例（68%）停药，最常见的原因是出现疾病进展和其他原因（各10例），8例由于不良事件（AE）停药。在既往接受BTK抑制剂和BCL-2抑制剂的24例CLL/SLL患者中，19例（33%）停药，最常见的原因是出现疾病进展和其他原因（各6例），以及AE（4例）。
在数据截止日期（2022年4月8日），CLL/SLL患者的中位随访时间为8.1个月（0.1~38.8）；32例患者达到客观缓解（ORR；CR，2例；PR，15例；PR-L，15例）。在32例缓解患者中，中位DOR为24.4个月，中位PFS为26.3个月。
在纳入安全性分析的所有接受65 mg nemtabrutinib治疗的B细胞恶性肿瘤患者（n=112）中，82例（73%）发生了任何级别的TRAE，最常见（≥10%）的是味觉障碍、中性粒细胞减少、疲乏、恶心和血小板减少、以及腹泻和高血压。45例患者（40%）发生3级或4级TRAE；最常见（≥5%）的是中性粒细胞减少以及血小板减少和淋巴细胞增多。15例患者（13%）发生治疗相关停药。无给药相关的死亡。
结论
总而言之，在既往接受过新型药物治疗的高度复发/难治性人群中，nemtabrutinib 65 mg持续显示出有希望的和持久的抗肿瘤活性，且安全性特征可管理。
摘要号4002：GB5121是一种脑渗透性、不可逆BTK抑制剂，在新型颅内淋巴瘤小鼠模型中表现出强效抗肿瘤活性
研究介绍
GB5121是一种脑渗透性、强效、高选择性、不可逆的小分子BTK抑制剂，具有改善中枢神经系统（CNS）恶性血液病患者预后的潜力。在此，使用[11C]PET示踪剂评估了GB5121在非人灵长类动物（NHP）中的脑渗透性，并在临床前淋巴瘤异种移植模型中评估了体内疗效。
研究方法
使用[11C]GB5121 PET配体在NHP中评估GB5121脑渗透。对两只恒河猴静脉给予[11C]GB5121 PET配体，并在基线和90 min内收集PET扫描。在皮下（SC）和原位TMD8细胞系来源的异种移植（CDOX）小鼠模型中评价了GB5121的抗肿瘤活性。
对于SC模型，小鼠（n=10）每日经口给予GB5121或伊布替尼，持续24天。对于原位模型，将TMD8细胞植入颅内；植入后14天的动物（n=12）每日一次接受GB5121或伊布替尼经口给药28天。在植入后第28天和第35天通过MRI测量肿瘤体积。测定血浆中的人IL-10水平，并在研究终止或人文终点时通过免疫组织化学（IHC）测定脑中人CD20阳性细胞的百分比。在一个小鼠队列（n=3）中，在脑中测量BTK靶点结合率（TO），并在第35天给药后1小时测量所有组血浆和脑中的药物暴露量。
研究结果
在NHP接受[11C]GB5121的PET成像证实CNS渗透与之前在NHP中进行的药代动力学研究一致，证明游离血浆GB5121可以不受阻碍地进入CNS。在TMD8 SC肿瘤模型中，GB5121治疗剂量在10和30 mg/kg剂量下均导致肿瘤生长完全抑制。在颅内CDOX模型中，与赋形剂处理的小鼠相比，GB5121处理导致生存期延长，在10和30 mg/kg剂量下，分别有90%和100%的小鼠存活至研究终止。相比之下，伊布替尼治疗的动物未表现出显著的生存获益，与赋形剂组的46%相比，58%的小鼠在研究终止时存活。
GB5121还显示肿瘤负荷降低（通过MRI测定）和hCD20染色（通过IHC测定）。此外，在给予30 mg/kg GB5121的小鼠血浆中，作为临床肿瘤负荷生物标志物的人IL-10水平显著降低。最后，在一个荷瘤小鼠队列中，GB5121的脑暴露量和BTK TO均高于伊布替尼。
结论
GB5121作为一种脑渗透性BTK抑制剂，PET成像研究证实了先前进行的NHP PK研究的结果，证明了GB5121的CNS渗透性。在新型颅内淋巴瘤模型中，GB5121给药的抗肿瘤活性优于伊布替尼，这可能是由于脑渗透性和TO较高所致。GB5121显示的较高的脑渗透性和TO可能在CNS受累的恶性肿瘤中产生更持久的缓解，并支持在CNS淋巴瘤临床试验中对GB5121的研究。因此，目前正在复发/难治性原发性/继发性CNS淋巴瘤或原发性玻璃体视网膜淋巴瘤（STAR CNS；NCT05242146）成人患者的Ⅰb/Ⅱ期开放标签、国际研究中评估GB5121。
摘要号4438：非共价BTK抑制剂在CLL和Richter转化患者中的治疗结局和耐药突变
研究介绍
非共价BTK抑制剂（ncBTKi）在R/R CLL和Richter转化（RT）患者中显示出良好的临床活性。然而，部分接受ncBTKi 治疗的患者仍会发生疾病进展（PD）。此外，最近报告了ncBTKi治疗出现PD时的获得性BTK突变（mut），但目前尚未报告这些突变发生的频率，也缺乏ncBTKi治疗后进行测序的相关数据。
研究方法
对接受任何ncBTKi 治疗且因任何原因停用ncBTKi的CLL/RT患者进行了一项回顾性、多中心研究。主要研究终点为ncBTKi治疗后的ORR。此外，还收集了停用ncBTKi的CLL患者的NGS数据。
研究结果
共63例患者（48例CLL，15例RT）接受治疗，然后停用ncBTKi。既往治疗的中位数为4(1~10)，大多数患者既往接受过共价BTK抑制剂（93.7%）和维奈克拉（57.1%）治疗。在ncBTKi治疗开始时，84.8%的患者伴有IGHV未突变，48.8%有TP53 mut，37.0%有复杂核型。
CLL队列ncBTKi的ORR为58.8%（PR 54.4%，PR-L 4.4%），RT队列为46.7%（CR 6.7%，PR 40%）。对于CLL和RT，停药前ncBTKi暴露的中位持续时间分别为9（1~27）和4（1~12）个月。总体而言，组合队列中73.7%的患者在ncBTKi治疗期间发生PD。ncBTKi停药的具体原因包括：CLL 的PD、现有RT的PD、非继发于PD或毒性的死亡、其他原因、干细胞移植（SCT）、毒性、CLL至RT的PD、MD/患者的选择、CAR-T和治疗期间猝死。
ncBTKi治疗后，76.2%的患者（n=48）接受了二线治疗。常见的治疗策略为：化疗+/-免疫治疗（CIT，ORR 18.8%）、CD19靶向CAR-T细胞治疗（ORR 85.7%）、allo-SCT（ORR 83.3%）和基于维奈克拉的治疗（ORR 70.0%）。27.3%在ncBTKi后进行的治疗是在临床试验中进行的。
对于CLL患者，ncBTKi后进行二线治疗的中位PFS为14个月（n = 25，图3）。对于RT队列，ncBTKi停药后进行二线治疗的中位PFS为6个月（中位随访2.5个月）。重要的是，因CLL停用ncBTKi后，维奈克拉的中位PFS为14个月（8例患者，87.5%未接受过维奈克拉治疗，中位随访10.5个月）。整个队列中49.2%的患者死亡，其中58.6%的死亡（根据现有数据，n = 17/29）是由于CLL或RT。
15例因PD停用ncBTKi的CLL患者有可用的治疗结束NGS数据。对于这些患者，在ncBTKi开始时，BTKC481 mut和PLCG2 mut分别占38.5%和33%。ncBTKi治疗结束时，在9/15例患者（60.0%）中发现新型（非C481）BTK突变。这些包括BTKL528W、BTKV416L和BTKT474I中的mut；1例患者在BTKT474I和BTKL528W中均有mut。此外，4例患者的PLCG2中既存mut在PD时持续存在。总体而言，11/15例（73.3%）CLL患者在ncBTKi PD时有新的BTK突变和/或持续PLCG2突变。
结论
CIT治疗RT和CLL的结局较差，而CAR-T细胞治疗和allo-SCT的ORR较高，值得进一步研究。最重要的是，维奈克拉在ncBTKi停药后对CLL患者具有临床活性（高ORR，持久PFS）。此外，在PD时，73%的患者有新型BTK突变和/或持续存在PLCG2突变，导致对ncBTKi耐药。总体而言，这些结果强调了ncBTKi后需要治疗的患者对新型治疗策略的未满足的临床需求。
图3.ncBTKi停药后的PFS
摘要号4626：BTK抑制剂通过调节免疫系统改善CAR-T19细胞治疗
研究介绍
CD19靶向嵌合抗原受体-T（CAR-T19）细胞治疗在B细胞淋巴瘤和白血病中显示出显著疗效。然而，如何延长其缓解持续时间和减轻毒性，仍然是目前所面临的挑战。BTK抑制剂广泛用于淋巴瘤，可作用于T细胞和骨髓细胞。本研究旨在系统地探索三种BTK抑制剂[伊布替尼(IB)、泽布替尼(ZB)、奥布替尼(OB)]对T细胞、CAR-T19细胞和肿瘤微环境的影响。
研究方法
用CD3/CD28和CAR-T19细胞刺激T细胞，并在三种BTK抑制剂存在下培养4天和14天。监测群体倍增数和细胞活力，流式细胞仪（FCM）分析活化和耗竭表型（CD25、CD69、PD-1、TIM-3、CTLA-4）。评估CAR-T19对NALM-6细胞的细胞毒性，用于24小时共培养。将辐照的CD19-K562细胞加入CAR-T19细胞中，每4天两次，并补充三种BTK抑制剂。然后收获 CAR-T19细胞以评估细胞毒性和mRNA表达。在M-NSG小鼠中建立皮下致瘤模型，以评价体内协同效应。共培养PMA刺激后从THP-1分化而来的CART19、NALM-6和巨噬细胞，通过细胞计数珠试验检测上清液中的IL-6和TNF-α。在BALB/c小鼠中建立皮下致瘤模型，评估BTK抑制剂对肿瘤微环境的影响。
结果
加入3种 BTK抑制剂4天和14天时，可不同程度下调T细胞上活化和抑制受体的表达。补充IB 4天和14天均可降低CAR-T19细胞上活化和抑制受体的表达。加入IB 14天后，T细胞和CAR-T19细胞的群体倍增大部分增加，这可归因于细胞活力改善（T细胞：P=0.0005；CAR-T19细胞：P=0.0059）。IB联合给药14天可增强CAR-T19细胞的细胞毒性。RNA序列突出显示BTK抑制剂下调T细胞活化相关信号通路，如JAK-STAT（P=0.0299）（图4A）。所有 BTK抑制剂均改善了暴露于连续辐照CD19-K562细胞的CAR-T19细胞的细胞毒性（IB：P<0.0001；ZB：P<0.0001；OB：P<0.0001)。qRT-PCR分析显示BTK抑制剂降低PD-1、TIM-3和CTLA-4的mRNA表达（图4.B）。
在皮下致瘤模型中，生物发光成像监测显示IB组肿瘤负荷减轻（P=0.0274）。第28天，IB和OB增加了肿瘤组织和骨髓中的CAR-T19细胞比例。在离体肿瘤微环境模型中，BTK抑制剂下调了IL-6（IB：P=0.0270；ZB：P=0.0629；OB：P=0.0028）和TNF-α (IB：P=0.0250；ZB：P=0.0578；OB：P=0.0981) 的水平。在皮下淋巴瘤模型中，三种BTK抑制剂减少了肿瘤浸润巨噬细胞（IB：P=0.0158；ZB：P=0.0186；OB：P=0.0554）和受阻的2型巨噬细胞 (IB：P=0.0061；ZB：P=0.0079；OB：P=0.0262)。
结论
综上所述，本研究数据揭示了BTK抑制剂阻止了强烈的激活，持续的紧张性信号传导和连续的抗原特异性刺激。BTK抑制剂给药损害了体外分泌IL-6和TNF-α的巨噬细胞，并减少了体内肿瘤相关巨噬细胞。研究提供的证据表明，与BTK抑制剂联合是一种通过调节免疫系统改善CAR-T19细胞治疗的潜在治疗策略。
图4. (A)CAR-T19 细胞的基因集富集分析;(B)BTK抑制剂通过降低抑制性受体表达，增强两轮辐照CD19-K562刺激的CAR-T19细胞的细胞毒性我是图注
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