近期，浙江大学医学院附属第一医院（以下简称浙大一院）黄河教授、李明定教授团队发表在《自然》杂志（Nature）上一篇题为Non-viral, specifically targeted CAR-T cells achieve high safety and efficacy in B-NHL的文章，提供了一种基于CRISPR-Cas9技术、非病毒载体的CAR-T细胞制备方法，并展望了其应用前景。
研究背景
近年来，嵌合抗原受体(CAR)-T细胞治疗迅速发展，在抗肿瘤领域展现出巨大的潜力。然而，目前的CAR-T治疗方案仍然存在一些局限性，包括生产工艺复杂、生产成本高、制备时间长和潜在的安全问题。使用病毒载体进行CAR-T细胞生产是一个备受关注的新议题，因为这种方法可能导致插入突变，进而增加肿瘤进展的风险。此外，病毒衍生DNA诱发的特异性反应往往也会阻碍CAR的表达。相关病毒载体的制造往往也需要付出高昂的成本。前沿研究已经探索出一些有效策略，如使用转座子系统和mRNA转导技术，来产生无病毒成分的CAR-T细胞，但由于随机整合和CAR-T表达中断导致的最终产物的低同质性成为了新的问题。
近期有研究表明，通过使用腺相关病毒(AAV)载体作，可将基因组编辑技术应用于生成特异性CAR-T细胞。此外，非病毒策略也开始逐步被用于生产具有点突变校正和精确插入的T细胞受体(TCR)-T细胞产品。因此，为了同时解决病毒技术和随机整合的缺点，该研究基于CRISPR-Cas9技术，开发了一种非病毒、基因特异性靶向的CAR-T细胞，并证明了其治疗复发/难治性(r/r）B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL)患者具有良好的安全性和有效性。
研究方法
该研究首先尝试了优化现有的非病毒、基因特异性T细胞的生产方案。既往报道提出了一种以线性双链DNA(dsDNA)形式存在的同源定向修复(HDR)模板，可以实现较高的同源重组效率和细胞活力。当使用800 bp的同源臂对受到刺激的T细胞进行电穿孔时，可以获得更多携带靶向基因整合的活细胞。为验证这一概念，该研究设计并整合生成了多种CAR，并评估了这种非病毒的转染方法是否会影响CAR-T细胞的特性。
图1通过CRISPR-Cas9进行同源重组产生的CAR-T
研究结果
AAVS1-19bbz细胞的基本特征
研究者构建了一个包含4-1BB和CD3ζ(命名为19bbz)的抗CD19 CAR序列。19bbz与AAVS1的整合效率约为10%(最高可达19.8%)，基因序列插入的比例则为67% ~ 87%。随后，该研究全面比较了AAVS1-19bbz和基于慢病毒产生的LV-19bbz抗CD19 CAR-T细胞。
虽然电穿孔过程本身导致了一些细胞损伤，但T细胞的扩增并没有受到损害，且在完全恢复后检测到较高的细胞活力。虽然慢病毒感染导致CD4+细胞中CAR+细胞的比例高于CD8+细胞，但通过电穿孔实现的整合在CD4+和CD8+细胞之间没有偏差，而且与慢病毒转导相比，电穿孔增加了CD8+/CD4+ T细胞的比例，这一结果与既往研究一致。AAVS1-19bbz细胞对肿瘤细胞的反应与LV-19bbz细胞一样。相比之下，二者在细胞标志物表达和细胞因子分泌方面存在一定差异。值得注意的是，与LV-19bbz细胞一样，AAVS1-19bbz细胞在体外和体内都能有效地清除肿瘤细胞。因此，基于非病毒模式生产基因特异性靶向CAR-T细胞的策略是可行的。
图2 AAVS1-19bbz细胞扩增政策，且能够有效地清除肿瘤细胞
已知阻断PD1/PD-L1通路可提高CAR-T细胞的抗肿瘤活性，因此该研究通过将抗CD19 CAR序列整合到PD1基因(PD1-19bbz)中来开发一种增强的CAR-T细胞。20%(最高可达30.3%)的健康供体T细胞中能够观察到CAR表达，并且检测到高达83 % ~ 93%的基因序列插入比例和PD1损伤。经表达PD-L1的Raji细胞反复刺激后，PD1-19bbz细胞的增殖能力高于LV-19bbz细胞。
为了充分了解PD1-19bbz细胞的特性，我们使用慢病毒和CRISPR - Cas9(LV-19bbz_PD1-KO)制造了PD-1敲除的CAR-T细胞，并在不同组别中进行了平行分析。尽管某些细胞标志物的表达有所不同，但PD1-19bbz细胞总体上表现出与其他CAR-T细胞相似的CAR表达水平，以及增强的抗原独立和抗原依赖的信号传导。值得注意的是，与其他组相比，PD1-19bbz细胞对表达高水平或低水平PD-L1的肿瘤细胞均表现出更强的清除能力。总的来说，这些数据表明非病毒转染、PD-1整合的CAR-T细胞更有效地消除肿瘤细胞，更具治疗潜力。
图3 PD1-19bbz细胞抑瘤效果优于LV-19bbz细胞
PD1-19bbz细胞治疗r/r B-NHL的效果
基于临床前实验的数据，该团队继续开展了I期临床试验，以评估PD1-19bbz细胞治疗r/r B-NHL患者的安全性和有效性（ClinicalTrials.gov注册号：NCT04213469)。8名既往没有接受过CAR-T细胞治疗的患者被纳入研究。在最终的输注产物中，CAR整合度和PD1插入的平均百分比分别约为20%和60%。输注产物的细胞活力大于90%，并且针对肿瘤靶细胞的体外试验中实现了缓解和清除的效果。
患者接受环磷酰胺和氟达拉滨联合的淋巴細胞清除性化疗方案，随后接受每公斤体重0.56 × 106 ~ 2.35 × 106细胞剂量的PD1-19bbz细胞输注1次。虽然所有患者都经历了短暂而可逆的血液毒性事件，但未发现其他高级别(≥3)不良事件；而且这些副反应主要与化疗预处理有关。在部分患者中观察到轻微的细胞因子释放综合征(CRS)，但没有发生免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)。PD1-19bbz细胞在体内正常增殖并存续。
PET-CT检测显示，在12个月的中位观察期间，8例患者中有7例(87.5%)实现了完全缓解(CR)；其中，5例患者在最后一次随访时实现了持久的缓解，2例患者在6个月时出现了疾病复发。其余1例患者实现部分缓解(PR)；因此，所有患者达到的最佳客观缓解率为100%。值得注意的是，即使在低灌注剂量和低CAR+细胞比例的情况下，PD1-19bbz细胞也具有一定的疗效。以上数据表明，非病毒转染、PD-1整合的CAR-T细胞对r/r B-NHL患者具有很高的安全性和有效性。
图4 非病毒转染、PD-1整合的CAR-T细胞治疗r/r B-NHL患者安全有效
针对PD1-19bbz细胞的单细胞分析
为进一步了解非病毒转染的PD-1整合CAR-T细胞的特性，该研究基于不同方法平行制备了一系列CAR-T细胞，并分别进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)。为阐明每种CAR-T细胞的特征，研究团队使用CD8+记忆和功能障碍/细胞毒性标记基因定义了两个群体，并分析了相关的记忆、功能障碍和细胞毒性基因的表达。
结果显示，CD8+记忆群中的细胞比例在非病毒、基因特异性靶向(PD1-19bbz, AAVS1-19bbz)的细胞中显著提高，无论整合位点如何。而与AAVS1-19bbz细胞相比，阻断PD-1使PD1-19bbz细胞的免疫应答能力增强。
图5非病毒转染、PD-1整合的CAR-T细胞的scRNA-seq分析结果
针对三个患者样本进行的scRNA-seq分析展示了输注前后PD1-19bbz细胞的特性。与临床前数据一致，在输注产品中检测到较高比例的CD8+记忆群。与免疫反应相关的多个基因组在预后较好的患者的输注产物中富集，提示输注前T细胞与CAR-T细胞治疗有效性之间具备潜在相关性。CAR+细胞灌注后，部分记忆基因持续表达，一些功能障碍和细胞毒性基因表达则相对减弱。体外数据和基因集富集分析(GSEA)显示， PD-1表达较低的CAR+细胞能够在体内发挥更强的增殖能力和免疫应答能力。因此，PD1-19bbz相较于AAVS1-19bbz，具备更多的记忆T细胞数量和增强的抗肿瘤免疫功能，能够实现更佳的治疗效果。
研究结论
这项研究描述了一种通过CRISPR-Cas9技术而非病毒转染，制备基因特异性靶向CAR-T细胞的新策略。该技术结合了非病毒制备过程和精准基因组编辑技术的优点，简化了制备过程、缩短了制备时间，同时降低了CAR-T细胞产品的生产成本，提高了CAR-T疗法的安全性和有效性。研究验证了非病毒转染、基因特异性靶向CAR-T细胞的疗效，并证明了该技术应用于正式大规模生产、继而应用于临床实践的可行性。此外，该技术针对位点的特异性整合增强了CAR-T细胞产品的同质性，使开发多功能细胞产品成为可能。
此外，PD1-19bbz细胞对肿瘤细胞具有显著改善的疗效，且scRNA-seq数据显示PD1-19bbz细胞中有较高比例的记忆T细胞。鉴于PD-1的缺失可以缓解PD-L1与T细胞接触引起的免疫抑制，基于该新型技术制备的PD-1整合的CAR-T细胞有潜力通过多途径抑制肿瘤的发展。而考虑到与PD1功能一致的抑制受体，如LAG3、TIM3和TIGIT在临床输注后仍在PD1-19bbz细胞中高度表达，未来或可探索同时干预多个途径，进一步增强CAR-T细胞的功能。
总而言之，该研究实现了CRISPR-Cas9技术制备CAR-T从临床前实验到临床研究及实践中的应用，并在B细胞恶性肿瘤患者群体中证明了其优越的安全性和有效性。因此，这一创新的CAR-T技术证实，CRISPR-Cas9介导、非病毒转染的基因特异性靶向技术在细胞治疗中具有巨大潜力，有望为目前的细胞治疗领域带来更大突破。
Zhang J, Hu Y, Yang J, Li W, Zhang M, Wang Q, Zhang L, Wei G, Tian Y, Zhao K, Chen A, Tan B, Cui J, Li D, Li Y, Qi Y, Wang D, Wu Y, Li D, Du B, Liu M, Huang H. Non-viral, specifically targeted CAR-T cells achieve high safety and efficacy in B-NHL. Nature. 2022 Sep;609（7926）:369-374. doi: 10.1038/s41586-022-05140-y. Epub 2022 Aug 31. PMID: 36045296; PMCID: PMC9452296.
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