近期，浙江大学医学院附属第一医院（以下简称浙大一院）黄河教授、李明定教授团队联合开展的临床研究成果发表在《自然·通讯》杂志（Nature Communications）上一篇题为‘’CAR-T cell therapy-related cytokine release syndrome and therapeutic response is modulated by the gut microbiome in hematologic malignancies的研究，通过检测B细胞恶性肿瘤患者接受CAR-T细胞治疗过程中的外周血与粪便样本，评估了肠道菌群在CAR-T治疗过程中对其疗效和细胞因子释放综合征等副反应的调节作用。
研究背景
B细胞来源的血液恶性肿瘤包括急性淋巴细胞白血病（B-ALL）、非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）和多发性骨髓瘤（MM），在常规化疗后复发的可能性很高。基于单克隆抗体、双特异性 T 细胞接合剂（BiTE）抗体和造血干细胞移植（HSCT）的新治疗策略的应用，B细胞来源血液肿瘤的治疗效果已经得到大幅改善。然而，仍有一部分患者会进展为复发/难治性疾病，预后较差，亟待更佳治疗策略。嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法的出现为这部分患者提供了新选择，并在临床研究及实践中取得了令人鼓舞的结果。然而，CAR-T细胞疗法的缓解率和免疫相关不良反应在不同患者之间存在着巨大差异；临床目前也没有可用的针对诸如细胞因子释放综合征（CRS）和全血细胞减少等毒副反应的生物标志物。
既往研究发现，肠道微生物群的多样性和组成差异可能会影响抗肿瘤免疫反应及相关治疗的效果。对PD-1单抗治疗的黑色素瘤患者粪便样本进行分析后，发现对治疗有应答的患者梭状芽孢杆菌/瘤胃球菌科的α多样性和丰度显著提高，而拟杆菌则在非应答者中显著富集。在血液系统恶性肿瘤中，也有报道称肠道细菌能够影响移植物抗宿主病（GVHD）和异体造血干细胞移植后感染的风险。然而，尚无研究显示肠道菌群在CAR-T治疗B细胞恶性肿瘤的疗效和毒性中的潜在作用。为解答这些未知问题，该研究探索了CAR-T细胞治疗的复发/难治性B细胞源性血液恶性肿瘤患者的肠道微生物组的变化，并评估了微生物与临床缓解情况和CRS严重程度的关系。此外，该研究还探索了肠道微生物组在预测治疗结果和CRS严重程度方面的潜力。
研究方法
此前该研究已报道61例B-ALL、B-NHL患者中期结果的安全性和有效性。其后，该研究（注册号：ChiCTR1800017404）进一步纳入了年龄小于75岁、CAR-T细胞治疗前复发或难治的BCMA阳性MM患者；入组患者预期生存期均大于12周，且有足够的性能状况和器官功能耐受治疗。于2018年7月1日至2021年9月30日期间收集研究数据和样本。基于患者外周血单个核细胞（PBMC）通过白细胞分离法制备CAR-T细胞。纯化的CD3+ T细胞经慢病毒载体转导后表达BCMA CAR，然后在IL-2刺激下进行体外扩增。所有患者均接受氟达拉滨和环磷酰胺进行淋巴衰竭，然后实施BCMA CAR-T细胞灌注。CAR-T治疗后第三个月评估主要缓解结果，包括完全缓解（CR）、非常好的部分缓解（VGPR）或部分缓解（PR），并评定CRS分级。
治疗期间收集受试患者的肠道微生物组样本和外周血液样本，并进行检测分析，评估其与治疗效果及副反应之间的关联。研究评估了CRS期间外周血的变化。此外，为了检测CAR-T治疗过程中肠道菌群的改变，每位患者收集了五次粪便样本（FCa、FCb、CRSa、CRSb和CRSc）以供检测。其中FCa为化疗前基线，FCb代表化疗后，CRSa代表CAR - T细胞输注后、CRS发生前，CRSb和CRSc分别代表CRS的高峰期和恢复期。
研究结果
排除无法获得样本和测序结果不达标的患者后，本研究共纳入81例r/r MM患者进行肠道微生物组分析，其中实验组43例，验证组38例。入组患者的中位年龄为59（范围：39~75）岁，55.8%为男性；既往治疗线的中位数为4（范围：2~8）。所有患者均接受过蛋白酶体抑制剂治疗，95.3%接受过免疫调节剂治疗。在入组时，39.5%的患者接受过自体干细胞移植，55.8%的患者患有髓外疾病。
BCMA CAR-T治疗MM患者安全有效
主要结果评估了CAR-T治疗的安全性。在新纳入的99例r/r MM患者中，有97%（96/ 99）例患者出现CRS，其中1-2级CRS 50例（52.1%），3级和4级CRS 分别有42例（43.8%）和4例（4.1%）。无5级CRS发生。11例（11.1%）患者发生神经毒性反应，分别为10例（10.1%）1级事件和1例（1.0%）2级事件，未见3级及以上神经毒性反应。经治疗后，所有CRS和神经毒性均得到缓解。BCMA CAR-T细胞输注后1个月内，有1例患者死于脑出血，3例死于严重感染。
次要结果评估了BCMA CAR-T细胞治疗r/r MM的疗效和特性。除死亡病例外剩余的95例患者中，有91例（95.8%）实现总体缓解，其中分别有55.8%、15.8%和24.2%的患者实现了CR、VGPR和PR。中位随访时间为21.2个月，中位无进展生存期（PFS）为12.2个月；1年OS和PFS率分别为0.71和0.51。BCMA CAR-T细胞在体内急剧扩增，灌注后外周血BCMA CAR-T/CD3+ T细胞百分比在第11（范围：5~31）天达到峰值，中位值为81.95%（范围：6.07%~97.30%）。
CRS期间患者外周血炎症因子升高、免疫细胞减少
CAR-T细胞输注后，CRS的主要炎症标志物细胞因子在患者血清中显著升高，包括IL-6、IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α；血清炎症因子升高、免疫细胞减少。CRS期间，外周血中BCMA CART/ CD3+ T细胞百分比和血清IL-10浓度均增加，且CR组和PR组之间差异显著。患者体温、C反应蛋白（CRP）、铁蛋白和乳酸脱氢酶（LDH）浓度升高，3级CRS与1级CRS中IL-6和IFN-γ浓度有显著差异。血清免疫球蛋白（IgG，IgA）和免疫球蛋白κ和λ轻链浓度在CAR-T输注后急剧下降。
CAR-T治疗影响肠道菌群丰度，早期阶段尤为显著
研究首先评估了MM患者CAR-T细胞治疗期间所有受试者肠道菌群的多样性。与早期相比，CAR-T治疗后细胞多样性显著下降（用Shannon指数衡量）。在NHL患者和ALL患者中也观察到了一致的肠道菌群变化趋势。在另外一个包含38名MM患者的独立样本钟，Shannon指数在不同治疗阶段的下降再次得到验证，且治疗进展与菌群丰度在早期阶段呈现出更强的相关性，FCa、FCb和CRSa的ρ值分别为0.71、0.73和0.68。晚期（CRSb和CRSc）的相关性则较弱，提示微生物组组成的变化可能与CRS有关。
MM患者CAR-T治疗过程中微生物组成的变化
在MM患者中，细菌群落以厚壁菌门和拟杆菌门为主。与基线相比，治疗后期厚壁菌门的丰度增加，拟杆菌门的丰度下降。进一步检测发现包括肠球菌、双歧杆菌和拉克诺螺旋菌在内的5个细菌属减少。大多数菌群改变会在治疗晚期更为明显。CAR-T治疗对9个细菌属的影响最为显著，其中肠球菌属在不同治疗阶段之间差异最大。
4. 肠道菌群种类及丰度影响CAR-T治疗缓解情况及生存结果
该研究进一步评估了肠道菌群成分变化与CAR-T治疗缓解情况的关系。鉴于VGPR组中只有6个受试者，研究仅对CR组和PR组之间进行了比较。在MM患者中，CRSb期CR和PR患者观察到微生物α和样本内多样性的显著差异。尽管在基线时没有检测到差异，但CAR-T灌注后PR患者的α多样性下降更显著，Shannon指数显著低于CR患者。CR组和PR组在不同治疗阶段的差异程度不同，最显著的差异出现在CRSb中。
该研究在CR和PR的MM患者中确定了30个具有不同发展模式的细菌属，大部分重要细菌属，如普拉梭菌（Faecalibacterium），罗氏菌属（Roseburia）和瘤胃球菌（Ruminococcus），经过CAR-T治疗后都在CR患者中富集。无论是在CAR-T治疗前还是治疗后，双歧杆菌属（Bifidobacterium）、普雷沃菌属（Prevotella）、萨特氏菌属（Sutterella）、颤螺菌属（Oscillospira）和科氏菌属（Collinsela）在CR患者中丰度均高于PR患者。
MM患者CAR-T治疗临床反应相关细菌属
在NHL患者中，CR人群与PR人群相比，以及与没有缓解（NR）的患者相比，普拉梭菌、双歧杆菌和瘤胃球菌显著富集，这与MM患者得到的结果一致。然而ALL患者中则观察到，NR人群存在双歧杆菌、罗氏菌属和科氏菌属的富集，这与MM和NHL的结果不同，但可能是由NR样本较小导致的。
在独立验证的38例MM患者中，CR患者萨特氏菌属、普雷沃氏菌属的丰度在治疗的各个阶段均高于非CR组。科氏菌属和双歧杆菌属则没有观察到显著差异。进一步分析显示，萨特氏菌属丰度处于最高分位患者的PFS显著延长，提示肠道菌群会影响CAR-T治疗后患者的生存。
CRS期间外周血成分变化影响肠道微生物代谢及丰度
发生严重CRS的患者存在双歧杆菌属、明串珠菌属（Leuconostoc）的菌群数量变化，这种变化影响了MM患者的脂肪酸代谢、谷胱甘肽代谢、聚糖降解等生物合成代谢通路。严重CRS患者粪便样本的微生物功能与炎症化合物相关的代谢或生物合成较高，包括与膦酸化及其代谢、氨基酸代谢、硫辛酸代谢、氨基糖、核苷酸糖代谢和抗生素合成相关的几种途径。其中，基于KEGG通路和代谢物的差异分析，谷氨酸和苯丙氨酸合成及代谢相关通路，以及脂多糖和类固醇生物合成途径都被认为在PR和CR群体之间存在差异。
在CR组和PR组之间存在差异。功能预测分析进一步确证了这一结果，提示氨基酸代谢在CAR-T治疗中的重要性。
不同CRS等级MM患者检测样本成分差异
研究还发现，CRS期间血清细胞因子浓度和外周血免疫细胞数量可能影响肠道微生物的丰度。最显著的是MCP-1和乳酸菌（Lactobacillus）、淋巴细胞和梭状芽胞杆菌（Clostridium）、IL-15和乳酸菌、白细胞和细孔菌（Veillonella）之间的关联。血清淋巴细胞水平与11个细菌属的丰度呈负相关，包括双歧杆菌属、颤螺菌属等与CRS水平相关的多个属。在CRS启动过程中起关键作用的M1和M2巨噬细胞与肠道微生物族群则无显著相关性。
研究讨论
既往研究已经揭示了肠道微生物群对于免疫检查点抑制剂治疗反应和生存结局的影响，本研究则探索了肠道微生物群与CAR-T治疗之间的联系。既往研究发现，CR和PR患者中一些丰度差异的细菌属参与免疫反应的调节；本研究则发现，CR患者群体中双歧杆菌属、科氏杆菌属等多个菌属存在差异化的富集。
该研究还描述了CAR-T治疗期间，肠道菌群与B细胞恶性肿瘤患者的缓解情况和CRS严重程度之间的关系。例如，萨特氏菌属的高丰度与CAR-T治疗后的CR和生存期延长相关。本研究中还观察到双歧杆菌属、罗氏菌属和科氏菌属在三种血液恶性肿瘤中的结果存在差异，这表明在不同的癌症类型和治疗方法中，部分细菌可能有不同的作用，特定菌群可能对癌症或疗法有特定的效果。
此外，作为一种常用的增强宿主免疫力的益生菌，双歧杆菌已在其他研究中被证实能够特异性刺激多种细胞因子（如IFN-γ）的产生，还可以通过激活免疫细胞和释放各种细胞因子来增强非特异性细胞免疫反应。因此，在CAR-T治疗中CRS患者中双歧杆菌丰度增加，提示多样化的双歧杆菌菌株组成可能是导致CRS的原因之一。双歧杆菌的种类、菌株组成及其与CRS的关系仍有待进一步研究。
尽管神经毒性是与CAR-T细胞治疗相关的另一种主要毒性，但由于本研究MM患者中出现神经毒性的人数非常有限，故无法分析与神经毒性发生率和严重程度相关的微生物组。为了探索CAR-T细胞治疗后微生物群和神经毒性之间的关系，未来需要更多的患者参与研究。
总而言之，该研究描述了经CAR-T治疗后，B细胞来源恶性血液肿瘤患者肠道微生物群的变化与影响；相关研究及发现有望提供新的治疗方案或生物标志物。对于B-ALL、B-NHL和MM患者而言，关注肠道微生物组的动态变化，可能有助于提升CAR-T治疗的效果，并预测预防CRS等副反应的发生，借此优化患者管理、带来更大的生存获益。
Hu Y，Li J，Ni F，Yang Z，Gui X，Bao Z，Zhao H，Wei G，Wang Y，Zhang M，Hong R，Wang L，Wu W，Mohty M，Nagler A，Chang AH，van den Brink MRM，Li MD，Huang H. CAR-T cell therapy-related cytokine release syndrome and therapeutic response is modulated by the gut microbiome in hematologic malignancies. Nat Commun. 2022 Sep 9;13（1）:5313. doi: 10.1038/s41467-022-32960-3. PMID: 36085303; PMCID: PMC9461447.
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