通过小分子 ATP 竞争性抑制剂拮抗致癌激酶已在临床上取得了巨大的成功，成为了一种广泛癌症治疗策略。不幸的是，这种靶向疗法经常会遇到耐药性，通常是由于基因改变导致激酶重新激活和药物不敏感性[1]。
近年来，细胞周期蛋白依赖性激酶 4 和 6 (CDK4/6) 逐渐成为了激素受体阳性（HR+）人类表皮生长因子受体2阴性（HER2-）乳腺癌的主要治疗方法。CDK4/6抑制剂通过 ATP 竞争性这些激酶靶点发挥靶向治疗的抗癌活性，然而，随着时间的推移，耐药性通常会出现。
激酶再激活的最常见机制之一是激酶结构域中的基因位点出现突变，重塑了药物结合袋，从而增加使其对 ATP 的相对亲和力超过药物。包括EGFR阳性非小细胞肺癌中的 T790M和BCR-ABL驱动的白血病中的 T315I突变等等，都是这种机制[2,3]。令人惊讶的是，此前虽然有众多学者对于乳腺癌CDK4/6抑制剂耐药的机制进行了研究，但是在对数千个肿瘤进行基因测序后，没有发现一个 CDK4 或 CDK6 激酶点突变。
为了进一步探索CDK4/6抑制剂耐药的生物机制，美国纪念斯隆凯特琳癌症中心的研究人员进行了一项研究[4]，在对1300多个乳腺癌患者肿瘤组织的基因信息进行分析后发现，CDK6 可以通过诱导和结合 CDK 抑制剂 INK4 蛋白（p18 INK4C）引发耐药。
同时，体外激酶测定以及小鼠肿瘤模型研究表明，p18 INK4C–cyclin D–CDK6 复合物阻断了 CDK4/6抑制剂与靶点的结合，抑制 INK4 表达或INK4与 CDK6 的结合可恢复 CDK4/6抑制剂的敏感性。
此外，研究人员还开发了一种CDK4/6抑制剂与 E3 配体结合的双功能降解剂。所得的两种先导化合物可有效降解 CDK4/6复合物，从而在体内产生显着的抗肿瘤作用。这一研究结果证明了，尽管 CDK4/6抑制剂治疗会出现耐药，但克服耐药机制后，重新靶向 CDK4/6 仍旧显示出有希望的治疗潜力。
相关研究以“INK4 Tumor Suppressor Proteins Mediate Resistance to CDK4/6 Kinase Inhibitors”为题，发表在顶级肿瘤研究杂志Cancer Discovery杂志上。
INK4 蛋白与 CDK4/6抑制剂治疗耐药
先前的研究已经确定野生型 (WT) CDK6 表达的上调是肿瘤在 CDK4/6抑制剂治疗期间恢复细胞增殖的一种潜在机制[5]。为了确定 CDK6 的过表达是否导致CDK4/6抑制剂主要靶点， G1 检查点激酶活性，的重新激活，研究人员从CDK4/6抑制剂治疗敏感（低 CDK6 ）和耐药（高 CDK6）细胞中免疫沉淀 CDK4 和 CDK6，并使用RB底物测定相关激酶活性。
结果发现，CDK4/6抑制剂敏感模型显示高水平的内在 CDK4 活性，即对 CDK4/6抑制剂敏感但表达很少的 CDK6。相比之下，CDK4/6抑制剂耐药模型表现出 CDK6 的高表达，并且这种高表达会导致 CDK4/6抑制剂耐药。
为了进一步寻找CDK4/6抑制剂的耐药机制，研究人员分别对CDK4/6抑制剂敏感和耐药细胞中的CDK4 和 CDK6 蛋白进行免疫沉淀 (IP) 以及质谱 (MS)分析，以探索与 CDK4 和 CDK6 具有相互作用的蛋白。
研究人员在 CDK4/6抑制剂耐药细胞中发现了7种与 CDK6 相关的蛋白质。在已知与 CDK4/6 相互作用并调节细胞周期的蛋白质中，INK4 蛋白 p15 INK4B和 p18 INK4C似乎是与 CDK6 结合较多的蛋白质。
通过对 1000 多个细胞系 (PRISM) 进行了无偏筛选发现， INK4 过表达（连同 RB1 丢失）是与 CDK4/6抑制剂耐药相关的最重要的基因组改变之一。也就是说， CDK6高表达导致 CDK4/6抑制剂耐药可能与INK4 蛋白密切相关。
基于之前 CDK6–INK4 的晶体结构，研究人员选择了 CDK6 中靠近 INK4 结合位点的候选残基，并对明显的 CDK6–INK4 交界处的残基进行定点诱变，这些点突变破坏了 CDK6 与 p15 INK4B 和 p18 INK4C 的相互作用。
为了证实 INK4 蛋白在介导耐药性中的作用，研究人员在 CDK6 高表达细胞中基因敲除CDKN2B (p15) 和CDKN2C (p18)，发现 p18 INK4C缺失可以部分恢复 RB 磷酸化对 CDK4/6抑制剂治疗的反应，而敲除p15 INK4B和 p18 INK4C几乎完全恢复CDK4/6抑制剂活性。
此外，为了阐明 INK4 蛋白对 CDK6 药物抑制作用的结构机制，研究人员单独检查了现有的 CDK6 以及INK4 复合物结构。结构叠加表明 CDK6 的 N-端在与 INK4 结合后向细胞周期蛋白 D 扭曲，从而显着地降低 CDK4/6抑制剂的有效结合袋体积。这种效应在 p18 结合的 CDK6 中最为突出，其中 p18 结合导致 CDK4/6抑制剂结合量急剧减少。
随后，研究人员使用重组 CDK6 和 p18 INK4C重构了复合物，证明添加 INK4 几乎可以完全阻止 CDK4/6抑制剂抑制 CDK6 活性。这些数据表明， CDK6-INK4 复合物对于CDK4/6抑制剂不敏感，导致了乳腺癌CDK4/6抑制剂耐药的发生。
最后，为了确定临床相关样本中 CDK6 高、CDK4/6抑制剂治疗耐药的普遍性，研究人员还分析了来自 1,115 名HR+ /HER2-患者的 1,366 个转移性肿瘤的基因组图谱，结果发现 1,115 名患者中有 190 名 (17%) 显示出至少一种可能与 CDK6 上调和对 CDK4/6抑制剂耐药相关的遗传改变。这些发现表明，INK4 和 CDK6 的协调上调广泛存在于众多乳腺癌患者中，这些患者但对于CDK4/6抑制剂可能存在原发性耐药。
靶向 CDK6 - INK4复合物的降解剂可以恢复CDK4/6抑制剂活性
由于 INK4-CDK6 复合物对当前一代 CDK4/6抑制剂具有抗性，研究人员探索了其他靶向该途径化合物的治疗潜力。最近，双功能降解剂 [蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC)] 已成为一种有希望的方法来靶向“不可成药”蛋白质并克服对小分子抑制剂的抗性。
此前，研究人员曾鉴定出了一种选择性 CDK6 降解剂 BSJ-03-123[6]，于是检查了它在 CDK6 高、CDK4/6抑制耐药细胞中的作用。BSJ-03-123 可以导致 CDK6 的剂量依赖性降解，但对 CDK4 没有影响。因此，BSJ-03-123 可以抑制 CDK4/6抑制剂抵抗细胞中 RB 的磷酸化和下游细胞周期信号的表达。然而，当相同的细胞在具有有效 CDK6 抑制或敲低的长期培养物中生长时，由于保留的 CDK4 活性，BSJ-03-123无法发挥抑制癌细胞增殖的活性。
为此，研究人员将CDK4/6抑制剂与cereblon E3连接酶结合，生成了一组 CDK4/6 选择性降解剂。其中，两种化合物BSJ-05-017 和 BSJ-03-096 在降解 CDK4 和 CDK6 方面表现出非常高的活性。。这两种化合物在 CDK4/6抑制剂敏感和抵抗细胞中均表现出对 RB 磷酸化和 E2F1-cyclin A2 表达的有效抑制。
为了评估 BSJ-05-017 在 CDK6 驱动细胞中的治疗潜力，研究人员进行了细胞增殖试验，结果发现 BSJ-05-017 在抑制增殖和诱导细胞周期停滞和衰老方面具有同等效力。
为了确定BSJ-05-017 和 BSJ-03-096在体内使用的潜力，研究人员在小鼠腹膜内或口服 (PO) 单剂量后评估了其药代动力学 (PK) 特性。BSJ-05-017 和 BSJ-03-096 均在血浆中显示出较高的药物暴露量以及良好的代谢稳定性，C max分别为 2.6 μmol/L 和 0.9 μmol/L。在给药后 24 小时，该化合物的浓度保持在 100 nmol/L 附近，仍高于体外CDK4/6 降解的IC 50。
鉴于这些有希望的结果，研究人员接下来评估了体内，这两种化合物在 CDK6-low 和 CDK6-high 细胞衍生的异种移植模型中的作用。与载体对照相比，BSJ-05-017 诱导 CDK4 和 CDK6 几乎完全降解，导致 RB1 磷酸化和 E2F1 表达显着抑制。从长远来看，CDK6 低表达的乳腺癌异种移植物对普通的CDK4/6抑制剂、BSJ-05-017 和 BSJ-03-096 敏感，而 CDK6 高表达乳腺癌异种移植物只能被 BSJ-03-096 以及BSJ-05-017持久抑制。
总结
本研究探讨了 CDK6 介导的耐药性的生物学机制，CDK6 的过表达导致 INK4 蛋白的上调和结合，然后作为药物的强竞争性抑制剂，但仅是 ATP 的弱竞争性抑制剂。因此，CDK6 的过表达形成了对药物不敏感的复合物，持续驱动 G1 进展和癌症生长。为了克服这一挑战，研究人员开发了一套新的双功能降解剂，可以有效地结合 CDK6，部分通过变构接触。特别是，研究人员发现了一种能够结合和降解 CDK4 和 CDK6 的降解剂并在对第一代 CDK4/6抑制剂具有抗性的癌症中表现出活性。
MCC号KIS22081326有效期2023-08-16，资料过期，视同作废。
MCC号KIS22081326有效期2023-08-16，资料过期，视同作废。
参考文献
1. Lovly C M, Shaw A T. Molecular pathways: resistance to kinase inhibitors and implications for therapeutic strategies[J]. Clinical Cancer Research, 2014, 20(9): 2249-2256.
2. Yun C H, Mengwasser K E, Toms A V, et al. The T790M mutation in EGFR kinase causes drug resistance by increasing the affinity for ATP[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2008, 105(6): 2070-2075.
3. Wander S A, Cohen O, Gong X, et al. The Genomic Landscape of Intrinsic and Acquired Resistance to Cyclin-Dependent Kinase 4/6 Inhibitors in Patients with Hormone Receptor–Positive Metastatic Breast CancerGenomic Mechanisms of CDK4/6i Resistance in Breast Cancer[J]. Cancer discovery, 2020, 10(8): 1174-1193.
4. Li Q, Jiang B, Guo J, et al. INK4 tumor suppressor proteins mediate resistance to CDK4/6 kinase inhibitors[J]. Cancer Discovery, 2022, 12(2): 356-371.
5. Yang C, Li Z, Bhatt T, et al. Acquired CDK6 amplification promotes breast cancer resistance to CDK4/6 inhibitors and loss of ER signaling and dependence[J]. Oncogene, 2017, 36(16): 2255-2264.
6. Brand M, Jiang B, Bauer S, et al. Homolog-Selective Degradation as a Strategy to Probe the Function of CDK6 in AML[J]. Cell chemical biology, 2019, 26(2): 300-306. e9.
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