EGFR，即表皮生长因子受体，是人表皮生长因子受体家族成员之一，可调节细胞增殖和信号转导，与抑制肿瘤细胞增殖、血管生成、侵袭、转移和凋亡有关。目前，EGFR已成为非小细胞肺癌、头颈癌、乳腺癌、胶质瘤、宫颈癌、膀胱癌等肿瘤治疗中的重要靶点。EGFR抑制剂从一代到三代都显示出相当好的疗效，显著改善了患者预后。但大多数患者会对该治疗产生耐药性。因此，基于第三代EGFR抑制剂的耐药性，了解复杂的耐药机制将有助于开发更先进的靶向治疗。
近期，在Journal of Hematology & Oncology上，四川大学华西医院李为民教授团队发表了一篇题为“Emerging strategies to overcome resistance to third-generation EGFR inhibitors”的综述，讨论了第三代EGFR抑制剂耐药的分子机制，并荟萃分析了克服耐药的最新策略、新挑战和未来的发展方向。【肿瘤资讯】现将该综述分为上下两篇，本文为上篇，主要整理第三代EGFR抑制剂耐药的分子机制。
EGFR是ErbB受体酪氨酸激酶（RTK）家族成员，由外显子边界和相关的细胞外、跨膜和细胞内蛋白结构域组成。
EGFR参与多个信号通路，调节众多细胞功能（图1A）。跨膜糖蛋白由富含半胱氨酸的胞外配体结合结构域、疏水跨膜结构域、胞质RTK结构域和C末端结构域组成。RTK结构域包含一个由5个β-折叠链和1个αC螺旋组成的N-叶和一个包含高度灵活激活环（A-loop）主要螺旋的C-叶。这两叶交界处的深裂隙形成ATP腺嘌呤环的结合口袋。三个保守结构元件的构象，即Asp-Phe-Gly(DFG)基序、αC螺旋和A-loop，关键调节催化结构域的激活或失活。当EGFR处于活性状态时，重要的催化残基D855位于ATP结合位点，稳定ATP负载复合物(DFG-in)和αC螺旋(αC-in)。在非激活状态下，EGFR形成Src样结构，包括闭合的a环、αC-out和DFG-In（图1B）。E
GFR可与配体结合后发生二聚化，如双调蛋白、β-细胞因子、表皮生长因子(EGF)、肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)和转化生长因子(TGF)。启动Ras/RAF/MEK、信号转导和转录激活子(STAT)、PI3K/AKT/mTOR和其他下游信号通路的细胞内酪氨酸激酶结构域的激活和自身磷酸化与胚胎发育和干细胞分裂密切相关。野生型(WT) EGFR蛋白过表达伴或不伴EGFR基因扩增或激酶激活突变，通过信号级联反应进一步增强细胞增殖、迁移、存活和抗凋亡反应，这些过程与多种类型上皮源性癌症的发生和发展密切相关，如非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、胶质瘤、头颈癌、宫颈癌、膀胱癌等。在这些肿瘤类型中，肺癌似乎是最常见的，具有异常增殖、转移和耐药的特征。因此，EGFR已成为抗肿瘤药物设计和开发的一个很有前途的靶点。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)在临床上已取得显著的治疗效果。然而，大多数患者在1~2年后对第一代和第二代EGFR-TKI产生获得性耐药。近一半患者的耐药机制与T790M突变有关。
虽然目前已经开发了靶向EGFR-TKI敏感突变和T790M突变的第三代EGFR-TKI。但不幸的是，EGFR基因和信号转导通路组分中不太常见的突变引起的耐药性依旧存在。除常见的二级 (T790M)和三级(C797S)突变外，还有其他EGFR突变（如L718Q、L796S和L792H突变以及20号外显子插入）、MET扩增、磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α (PIK3CA)突变、HER2扩增、癌基因融合、并观察到细胞周期相关基因的改变（图1C）。因此，迫切需要更好的策略来应对与第三代EGFR-TKI相关的不可避免的分子靶向耐药性。
图1. EGFR的结构和功能
第一代EGFR-TKI在EGFR的ATP结合口袋中与Met793形成氢键，并与ATP可逆性竞争结合。由于EGFR T790M突变（20号外显子上编码的疏水性ATP结合位点的Tr790被蛋氨酸取代）、亚克隆选择（遗传耐药克隆）和罕见EGFR突变（如G719X、S768I和L861Q）而发生耐药性。
第二代EGFR-TKI与第一代EGFR-TKI具有相同的喹唑啉活性，但侧链可以不可逆地与Cys797结合来抑制EGFR的酪氨酸激酶活性。例如，苯胺喹唑啉衍生物与铰链Met793的骨架形成氢键，并与疏水区相互作用。丙烯酰胺基团以EGFR的活性构象与Cys797共价结合，呋喃基暴露于溶剂中，3-氯4-呋喃苯基位于守门残基旁边。然而，第二代EGFR-TKI治疗后患者仍会出现T790M等突变，其对WT-EGFR的选择性有限，导致严重的副作用。
幸运的是，第三代共价抑制剂与靶标不可逆结合，具有突变选择性，且已经被开发出来。这些化合物是基于一种新的氨基嘧啶支架结构设计的，并表现出更好的生物活性。早期的临床试验已经证明这些第三代EGFR-TKI对双突变（EGFR L858R/T790M或ex19del/T790M）肿瘤患者有效，并且对EGFR突变具有高选择性，从而消除了与WT-EGFR非选择性抑制相关的皮肤和胃肠道系统的副作用。例如，已经发表的rociletinib(CO-1686)与EGFR T790M突变和EGFR L858R突变复合物的晶体结构；在EGFR T790M突变中，rociletinib的苯胺嘧啶基团与Met793酰胺和羰基骨架形成氢键，而在EGFR L858R突变中，rociletinib和蛋白质之间的疏水相互作用是由于嘧啶基团中的氮之间以及呋喃甲基和Tr790之间的氢键。此外，rociletinib中的丙烯酰胺基团与DFG-In/αC-In活性构象中的Cys797共价结合。EGFR T790M突变的特异性可能源于EGFR突变中的大蛋氨酸与嘧啶之间的疏水相互作用。
目前已获批上市的药物包括奥希替尼（美国）、阿美替尼（中国）、拉泽替尼（韩国）、伏美替尼（中国）（图2）。
图2 第三代EGFR-TKI的发展历程
由于第三代EGFR-TKI的丙烯酰胺（Michael受体）与EGFR激酶结构域中的活性巯基之间存在共价键，通过靶向Cys797和不可逆结合EGFR，实现了高度选择性的抑制活性；因此，这些化合物显示出优异的抗肿瘤活性。针对EGFR T790M突变和EGFR激活突变患者的靶向治疗在一线和二线治疗中均显示出良好的疗效。在对第三代EGFR-TKI（作为一线治疗）产生耐药性的患者中，已经报告了基因变化，例如MET扩增、EGFR C797X突变、PIK3CA扩增和突变、HER2扩增和突变、K-RAS突变和BRAF突变，以及细胞周期相关基因和癌基因融合的变化。但尚未检测到T790M突变。
二线治疗耐药的机制更为复杂。在患者中已检测到T790M突变的获得或缺失，也观察到其他EGFR突变（如L718Q、L796S、L792H和20号外显子插入）（图1B）。此外，第三代EGFR-TKI 获得性耐药的机制包括替代途径激活和组织学和表型转化（图3），详情如下。
图3. 获得性耐药的分子机制
原发性/内源性耐药
TKI对不同EGFR突变的敏感性不同是原发性耐药的原因。在NSCLC患者中，19号外显子缺失(ex19del)和21号外显子L858R点突变是最常见的体细胞突变，发生率约为80%。在EGFR-TKI治疗期间，中位生存期较长的患者表现为出现超过20个独特的19号外显子缺失。内源性耐药均可由其他非经典致敏突变（主要是20号外显子插入）和固有的继发性基因改变引发。
癌细胞群中可能已经存在耐药克隆（例如T790M），导致治疗期间耐药。一些研究发现，在近1%的肺癌患者中，治疗前可同时检测到2~3个驱动突变。据报道，一些分子和基因变化与内源性耐药性有关，如缺乏K-RAS/磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)的表达。这些预先存在的分子和基因改变可以刺激Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT下游通路促进肿瘤进展。
BIM缺失多态性
BIM是B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2) 家族的促凋亡成员。最近的研究表明，具有BIM缺失多态性和 EGFR突变的肺癌细胞对第三代EGFR-TKI耐药，提示BIM缺失多态性有可能作为预测第三代EGFR-TKI对患者疗效的生物标志物。
EGFR基因20号外显子插入
对20号外显子插入引起耐药的分子机制尚不完全清楚。Eck等人假设由于EGFR的N-叶增加了残基，该突变阻止与EGFR-TKI结合。D770_N771insNPG插入的EGFR基因20号外显子的晶体结构显示出不变的ATP结合袋和刚性的活性构象，导致药物结合口袋的空间位阻和对EGFR-TKI耐药。
获得性耐药
获得性耐药是指对治疗预先敏感的肿瘤细胞通过改变其代谢途径来规避药物的抑制作用的过程。第三代EGFR-TKI获得性耐药的机制可分为EGFR依赖性耐药和EGFR非依赖性耐药。
1、EGFR依赖性耐药机制
C797S突变
EGFR的一个点突变(C797S) 涉及ATP结合位点（20号外显子）内的Cys797被丝氨酸取代。奥希替尼通过与Cys797相互作用，与EGFR T790M共价不可逆结合。当发生C797S突变时，奥希替尼结合率降低，导致肿瘤对第三代EGFR-TKI耐药。
G796R/D突变
在接受第三代EGFR-TKI治疗的癌症患者中检测到G796R突变。分子对接预测发现，G796R在空间上阻碍了奥希替尼的共价结合。由于庞大的侧链和亲水基团阻碍了奥希替尼与疏水区域的结合，结合能的变化使得结合不利。与含有双突变型EGFR L858R/T790M的样本相比，含有三突变型EGFR L858R/T790M/G796R的样本对奥希替尼的耐药性高110倍。G796D首次在奥希替尼耐药的NSCLC患者中被报告。体外研究表明，G796D突变导致奥希替尼的生长抑制50%(GI50)值增加50倍。结构建模显示突变的G796D残基的侧链与奥希替尼的表面碰撞，导致空间位阻和能量排斥，最终失去结合亲和力。
L792突变
Leu792位点的突变包括L792F、L792Y和L792H。结构预测显示，这些突变在792残基侧链引入苯环或咪唑环，在空间上破坏奥希替尼的定向，从而潜在地影响奥希替尼与EGFR ATP结合位点的结合。
M766Q突变
与T790M和M766Q双突变体的同源性模拟表明，M766Q似乎将T790M定位在抑制剂结合位点，从而削弱奥希替尼的结合。
18号外显子突变
EGFR L718Q/V EGFR L718Q在对第三代EGFR-TKIs产生抗性的细胞模型中首次被报道。随后的研究表明， EGFR L858R/T790M/L718Q的NSCLC对所有EGFR-TKI均耐药，但仅L858R/L718Q的NSCLC对阿法替尼仍然敏感。晶体学模型发现，L718Q突变降低了丙烯酰胺弹头与Cys797巯基之间共价键形成的效率，从而干扰了奥希替尼的不可逆结合。此外，已检测到EGFR激酶结构域中的L718V耐药突变，这些突变可能干扰奥希替尼与激酶结构域的结合。值得注意的是，EGFR L718Q/V仍对阿法替尼敏感。
EGFR G724S ATP结合环中的G724S突变使甘氨酸富集，可通过改变蛋白质结构、增强ATP亲和力和稳定激活突变导致对EGFR-TKI产生耐药性。然而，该突变不会导致对第二代EGFR抑制剂耐药。
复合突变
复合突变是指在患者肿瘤细胞中同时检测到两种或两种以上不同类型的EGFR突变。复合突变对EGFR-TKI敏感性的影响按降序排列：双经典突变、涉及经典突变和罕见突变的复合突变以及仅罕见突变的复合突变。由第三代EGFR-TKI治疗引起的EGFR突变可导致对不可逆嘧啶TKI耐药，但不会导致对喹唑啉EGFR抑制剂耐药。
T790M减少或缺失
T790M的缺失可能是由于第三代EGFR-TKI治疗所致，也可能是与肿瘤异质性相关的耐药有关。在EGFR T790M突变患者中，耐药机制通常与C797S突变或代偿通路的异常激活相关，而T790M缺失的患者通常表现出不同的耐药机制，其中大多数与EGFR信号通路无关。
EGFR扩增
Piotrowska及其同事报告了罗昔替尼耐药克隆中的EGFR T790M等位基因扩增。Nukaga等人发现EGFR的WT等位基因的扩增足以介导对第三代TKI的耐药。耐药的机制可能是EGFR基因扩增导致TKI浓度相对较低，不足以发挥抑制活性。
2、EGFR 非依赖性耐药机制
并非所有患者都因EGFR突变对TKI产生耐药性；获得对第三代EGFR-TKIs耐药性的其他途径包括激活替代或下游信号通路、上皮间质耐药、上皮间质转化(EMT)、组织学和表型转化、癌基因融合和细胞周期相关基因异常。
旁路信号通路激活
MET异常激活
MET异常激活引起的耐药机制主要有两种：MET 14号外显子跳跃突变 (MET ex 14)和MET扩增。MET ex 14导致泛素连接酶结合位点的丢失、受体泛素化的减少和持续的MET激活，导致肿瘤细胞存活和获得性耐药。第三代EGFR-TKI治疗后，MET基因扩增可通过激活MAPK/ERK促进耐药，而MAPK/ERK不依赖于EGFR。
HER2扩增
Hus等人发现表达HER2D16的H1975细胞在体外对奥希替尼耐药。HER2D16可与EGFR形成异源二聚体或二硫键同源二聚体，从而激活下游信号传导，形成对奥希替尼的耐药性。HER2D16驱动的耐药性的发生方式与激酶Src无关。此外，还报告了HER2 20号外显子的其他突变，包括点突变（如G776C和L755S）和引起下游活化的插入。约2~4%的NSCLC病例发生HER2突变，主要发生在肺腺癌(LUAD)中。在NSCLC中，约3%未接受EGFR-TKI治疗的病例发生HER2致癌扩增，约占EGFR-TKI耐药病例的10%。
AXL激活
AXL是一种调节细胞存活、增殖、转移和其他细胞功能的RTK。AXL基因的异常可通过激活相关下游信号通路产生对TKI的获得性耐药。研究发现奥希替尼可以通过关闭与SPRY4相关的负反馈回路来触发AXL的激活，从而触发原有的奥西替尼耐药性。
HGF过表达
肝细胞生长因子(HGF)是原癌基因c-Met的配体；可通过EGFR旁路信号传导触发Met活化，并诱导肺癌对EGFR-TKI耐药。Yano等人发现HGF的高表达与肺癌患者对EGFR-TKIs的获得性和内在耐药性有关。在MET扩增和T790M突变的情况下，获得性耐药患者的肿瘤标本显示HGF高表达。
成纤维细胞生长因子受体(FGFR)信号转导
FGFR是一种跨膜RTK。研究表明，奥希替尼耐药患者的FGFR1扩增，成纤维细胞生长因子 2(FGF2)mRNA水平升高，提示FGFR2-FGFR1自分泌环可能与耐药有关。已报告T790M突变患者在奥希替尼和尼洛替尼治疗后显示疾病进展。在ctDNA中检测到FGFR3-TACC3融合。这些发现表明，FGFR信号通路的异常可能是第三代EGFR-TKI获得性耐药机制的基础。
胰岛素样生长因子受体1(IGF1R)
IGF1R是位于染色体15q26.3上的基因编码的跨膜异四聚体蛋白，参与促进肿瘤细胞的生长。IGF1R的异常激活导致EGFR-TKI耐药。
Aurora激酶(AURK)
AURK是丝氨酸/苏氨酸激酶家族中的一类重要酶，哺乳动物具有三个Aurora激酶家族成员（A，B和C）。AURK A和AURK B在分裂细胞中高表达，在有丝分裂进程中起重要作用。哺乳动物AURK A和AURK B在羧基端催化结构域的相似性约为71%。AURK A和AURK B的异常表达参与了广泛的实体瘤，并与不良预后和耐药性相关。此外，Tanaka等人报道靶向AURK B可以通过增强BIM-和PUMA-介导的细胞凋亡来预防和克服肺癌对EGFR抑制剂的耐药性。
下游信号通路激活
致癌受体下游信号通路的激活可以调节细胞增殖、细胞周期进程和细胞存活。因此，下游信号通路相关因子的直接调控可导致获得性耐药。
K-RAS突变
一项流行病学荟萃分析发现，NSCLC患者中存在K-RAS突变，所有携带K-RAS突变的患者均对EGFR-TKI耐药。K-RAS突变与RAS-MAPK通路的激活有关。常见的K-RAS突变包括G12S、G12D、G12A、Q61H和A146T。
研究发现，抑制K-RAS突变可以减少肿瘤生长，使NSCLC患者对EGFR抑制剂敏感。
BRAF（v‑RAF鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1）突变
BRAF是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在MAPK/ERK通路中起关键作用，包括在 EGFR/RAS/RAF信号转导中。BRAF可以调节细胞存活、增殖、分化和凋亡，以及肿瘤诱导。在包括肺癌在内的瘤种中发现了许多BRAF突变（G469A、V600E和V599E）。Ohashi等人报道称，在肺癌患者中，BRAF突变可诱导对EGFR-TKI的获得性耐药。临床前数据显示，BRAF V600E突变与T790M突变LUAD患者对第三代EGFR-TKI奥希替尼耐药有很强的相关性。
PI3K/AKT/mTOR
PIK3CA是LUAD的驱动基因。PIK3CA的突变可以促进肿瘤细胞侵袭，增加下游PI3K的活性。研究表明，奥希替尼耐药患者可能发生PIK3CA扩增或突变（包括E453K、E545K和H1047R）。PI3K活性增加导致各种下游激酶活化，从而在不与上游EGFR磷酸化偶联的情况下增加PI3K/AKT/mTOR通路活性。
STAT3活化
STAT蛋白，尤其是STAT3，是EGFR活化的关键下游信号传感器。在NSCLC的研究中，Zhao等人发现JAK2/STAT3在血管生成中的临床意义。Chaib等人发现奥希替尼治疗不仅激活了STAT3，还激活了SrcYAP1信号，可能作用于IL-6下游从而促进疾病进展。
PTEN缺失
PTEN是一种抑癌基因，编码一种具有脂质磷酸酶活性的蛋白，从而调节细胞蛋白磷酸酶活性。PTEN具有双重抗肿瘤作用，是体内许多信号通路的关键组成部分。如果PTEN基因突变或缺失或PTEN表达下调则会降低或消除其抗肿瘤活性，PTEN的缺失会导致PI3K/AKT信号通路的过度激活和产生对EGFR-TKI（包括奥希替尼）的耐药性。
活化的Cdc42相关激酶1(ACK1)的过度活化
ACK1的过度磷酸化和随后通过AKT通路激活的抗凋亡信号与第三代EGFR-TKI耐药相关。
c‑Myc基因
c-Myc基因是Myc基因家族的重要成员。c-Myc基因能诱导细胞不防御性增殖，并能促进细胞分裂；这些活性与各类肿瘤的发生、发展有关。研究表明，与相应的亲代细胞系相比，在对奥希替尼获得性耐药的不同EGFR突变NSCLC细胞系中，c-Myc水平显著升高；而且，奥希替尼不能降低这些增加的水平。与此一致，与治疗前相应的基线c-Myc水平相比，接受EGFR-TKI治疗后复发的患者，其大多数EGFR突变NSCLC组织中的c-Myc水平升高。这些发现表明，c-Myc影响了第三代EGFR-TKI的治疗效果和对这些TKI获得性耐药的发展。
其他机制
上皮-间质转化(EMT)
在EMT中，癌细胞通过E-cadherin的缺失而失去上皮特性，导致波形蛋白表达增加，转化为间充质表型。之前的研究发现，在没有其他EGFR突变的情况下，奥希替尼耐药的H1975细胞具有EMT特征。EMT是一个协调的过程，涉及多个调节因子，如EMT诱导的转录因子 (EMT—TF)、非编码RNA(ncRNA)和各种细胞外信号。EMT转录因子在EMT的各个阶段都起着重要作用；最广为人知的EMT转录因子是SNAIL、ZEB和TWIST家族的成员。许多研究表明，SLUG和SNAIL过表达可诱导耐药。
miRNA和EMT
长链非编码RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)在调节EMT和TKI耐药中发挥重要作用。尽管大多数miRNA被发现能抑制EMT，但有些具有促进EMT的活性，包括miR-21和miR-155。
一些miRNA可以通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进TKI耐药；例如miR-21和miR-23a可以靶向PTEN并激活AKT，导致对EGFR-TKI耐药。
表观遗传学改变
参与肿瘤起始和进展的表观遗传修饰包括DNA甲基化模式的变化和组蛋白修饰。肺癌的发生、发展过程中常见表观遗传学改变。研究表明，表观遗传疾病可使肿瘤患者对EGFR-TKI获得性耐药易感。
致癌基因融合
AURA-3和FLAURA试验表明，致癌基因融合可能是奥希替尼耐药的机制之一；已鉴定的融合包括转化生长因子受体(TGFR)-转化酸性卷曲螺旋蛋白3(TACC3)、神经营养受体酪氨酸激酶 1(NTRK1)-血小板生成素模拟肽3(TMP3)、ERC1-RET、SPTBN1-ALK、卷曲螺旋结构域蛋白6(CCDC6)-RET、GOPC-ROS1、AGK-BRAF、NCOA4-RET、ESYT2-BRAF和棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4)-ALK。致癌基因融合可与EGFR C797S突变、MET扩增和BRAF突变共存。
细胞周期相关基因异常
最近的研究表明，细胞周期相关基因的变化，包括CDKN2A E27fs突变、细胞周期蛋白D(CCND) 扩增、细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6) 扩增和细胞周期蛋白E1(CCNE1) 扩增，可引起对第三代EGFR-TKI的耐药。
组织学和表型转化
据报告，在3~15%的患者中，NSCLC向小细胞肺癌(SCLC)的组织病理学转化是EGFR-TKI获得性耐药的机制。转化的SCLC主要发生在携带EGFR-TKI敏感突变（如EGFR ex19del/T790M突变）且不吸烟的亚洲腺癌患者中。这种转化被广泛接受的说法是腺癌和小细胞肺癌起源于Ⅱ型肺泡细胞。RB1和TP53突变可能参与SCLC转化，但不足以诱导完全转化。其他基因组改变，包括激活PI3K/AKT家族和下调NOTCH信号的改变，以及影响MYC和SOX家族、AKT通路激活和其他分子的改变，也参与EGFR突变NSCLC的转化。然而，在其他情况下的确切机制尚不清楚。此外，最近发现鳞状细胞转化是获得性EGFR-TKI耐药的机制，在接受奥希替尼作为一线和二线治疗的患者中发生率约为15%。与SCLC 转化的情况相似，鳞状细胞转化中保留了原发性EGFR突变。
免疫逃逸
EGFR在不同的造血细胞类型中表达，包括巨噬细胞、单核细胞和某些T细胞亚群。因此，EGFR抑制剂很可能会干扰这些白细胞的功能。免疫检查点抑制剂(ICIs)在EGFR突变或继发性 T790M突变的患者中具有不良作用和较差的疗效，主要是由于肿瘤突变负荷较低和非炎症性肿瘤微环境。既往研究表明，分泌型磷蛋白1(SPP1)可促进LUAD中巨噬细胞M2极化和PD-L1表达，这可能影响对免疫治疗的应答。SPP1水平可能是EGFR突变患者免疫抑制的有用标志物，并可提示治疗新方向。此外，HGF、MET扩增和EGFR T790M突变导致NSCLC中PD-L1表达上调，并通过PI3K-Akt、MAPK和NF-κB通路介导的不同机制促进肿瘤细胞的免疫逃逸。
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Shi et al. Emerging strategies to overcome resistance to third-generation EGFR inhibitors. Journal of Hematology & Oncology (2022) 15:94.
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